IRES 與 2A peptide在同時表達多個目標基因中的應用比較

IRES & 2A peptide大比拼

導讀

  Hello! 大家好！有一個問題不知道大家考慮過沒有：為了研究單個基因的功能機制或實現多基因協同表達, 那這種同時表達多個目標基因該如何實現呢？

  實際上，目前廣泛采用多順反子表達方案,即利用內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)或自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide,2A)等元件來連接多個基因,實現在單個載體上表達多個多順反子的目的。

   那么，IRES和2A peptide各有何特點呢？今天我們就來總結一下，讓我慢慢道來~
 

IRES
 

     首先，人們發現，雖然一般真核mRNA的翻譯都需要5’帽子來介導核糖體結合，但真核生物和病毒中還存在一些例外情況，例如一些基因5端具有一段較短的RNA序列（約150-250bp），這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結構，從而介導核糖體RNA結合，起始蛋白質翻譯，這段非翻譯RNA被稱為內部核糖體進入位點序列（Internal ribosome entry site, IRES）。

   IRES元件具有不依賴帽子結構而獨立募集核糖體的功能,進而可以啟動下游基因的翻譯。眼前一亮有沒有？ 人們可以利用這個元件進行多順反子的共表達。

Figure 1.A diagram of the Dicistroviridae RNA genome. Dicistroviruses are naturally dicistronic with two open reading frames that are translated by independent IRESs. The non-structural proteins are translated by the 5＇IRES whereas the structural proteins are translated by the IGR IRES. A genome-linked viral protein (Vpg) and the poly(A) tail (An ) are indicated^[1].
 

   內部核糖體進入位點（IRES）是天然存在于一系列mRNA中的翻譯增強子，當存在于目的基因之間時介導翻譯的內部起始（圖2）。因此，IRES可以通過設計類似于細菌操縱子的多順反子表達盒，驅動由相同mRNA編碼的幾個基因的翻譯。

    處在IRES元件前后的兩個基因相對獨立,可以表達得到完整的目的蛋白。但由于IRES的結構較大,其應用常受到載體容量的限制,并且IRES對位于其后的基因翻譯起始能力相對較弱。

Figure 2. Cap-dependent and internal ribosome entry site-dependent initiation, two alternative mechanisms of translation. A: The so-called cap-dependent ribosome scanning mechanism predicts that ribosome 40S subunit binds to the mRNA 5’ end. Ribosome binding requires the initiation factor 4F (eIF-4F, composed of the three proteins eIF-4E, -4A and -4G). Then the mRNA is unwound under the control of the helicases eIF-4A and -4B, allowing the ribosome to scan the mRNA until recognition of an initiation codon (classically AUG); B: When an Internal ribosome entry site (IRES) is present in the mRNA 5’ untranslated region, IRES trans-acting factors (ITAFs) allow ribosome 40S internal recruitment, independently of the presence of cap and eIF-4F. The IRES-dependent mechanism occurs in the case of picornavirus uncapped mRNAs as well as for cellular capped mRNAs^[2].
 

2A peptide
 

   但是如上所述，IRES有共表達兩種基因表達量不均衡的問題，要解決這個問題，自剪切2A肽的構建策略近年來越來越收到了廣泛關注。

   2A肽被發現于口蹄疫病毒（FMDV），是從其中鑒定出的一種“自裂解”小肽，其平均長度為18-22個氨基酸。最初，人們推測病毒編碼蛋白或宿主細胞蛋白可能無法被切割。然而，該受體介導了在C-末端2A肽上合成異戊酰基脯氨酸肽的三聚體，導致2A肽之間立即被切割，下游肽具有脯氨酸N-末端(圖3)。

Figure 3. Schematic representation of cleavage occurring in a peptide translated in foot-and-mouth disease virus (FMDV). 1D, 2A and 2B indicate contiguous endogenous peptides translated in FMDV. The arrowhead indicates cleavage site^[3].

    2A元件在翻譯過程中形成的高級結構對核糖體肽基轉移酶中心造成空間位阻,導致無法形成正常的肽鏈連接,但同時核糖體卻能繼續翻譯下游蛋白,從而形成一種類似蛋白水解酶的作用將前后兩個蛋白順式“切開”。

     2A 肽結構短小并且上下游基因的表達平衡性好。但由于其獨特的“剪切”機制,導致最終分別得到一個融合有2A肽尾巴的上游蛋白和一個N端帶有一個脯氨酸的下游蛋白,額外增加的2A肽結構可能會對目的蛋白的功能造成一定的影響。

Figure 4.(A)Two individual polypeptides can be generated from one transcript using 2A to link the individual genes. (B) 2A peptide sequence and its cleavage site(G/P)^[4]

  綜上所述，IRES“同時轉錄，獨立翻譯”，2A peptide“同時轉錄，同時翻譯”，兩者都用于多蛋白同時表達。但由于IRES和2A peptide兩者各自存在的優缺點,在體外實驗中人們通常需要構建兩種或多種不同的表達載體來進行比較,才能找到最合適的表達方案。

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參考文獻:

[1]Tricks an IRES uses to enslave ribosomes.

[2]Internal ribosome entry site-based vectors for combined gene therapy.

[3]High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice.

[4]Use of the Foot-and-Mouth Disease Virus 2A Peptide Co-Expression System to Study Intracellular Protein Trafficking in Arabidopsis

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