線性范圍對western blot定量有什么影響

當western blot進行定量時，許多人認為只需將感興趣的蛋白質成像，剝離，重孵育內參蛋白，然后將其用于歸一化，而不考慮線性范圍的檢測。 然而，與此有關的幾個誤區，越來越多的期刊現在要求一個適當的定義的標準化流程，包括線性檢測的證明，還包括所有草稿。

線性檢測是條帶強度與膜上目標蛋白成比例的區域。 隨著蛋白量增加，條帶強度應該增加。 在下面的圖片中，您可以看到問題在哪里，線性范圍標有藍色框，在該區域之外，該比例關系丟失，特別是在信號完全過飽和或極低的表達量時。

蛋白質印跡的定量在目標蛋白和上樣對照兩者都具有相似的線性范圍的情況下，蛋白質印跡定量才是真正準確，因此，當上樣質控對照被考慮時，事情變得更復雜。 這在下面的兩張圖中顯示; 在第一個檢測線性范圍重疊的地方，蛋白質在該重疊區域內的定量將是很好的。 然而，在后者中，它們不重疊，容易看出蛋白質濃度的變化如何影響一種蛋白條帶強度，而不影響另一種蛋白質的條帶強度。 在這種情況下，定量是不準確的。

確定線性范圍相對容易，可以通過樣品并進行連續稀釋來實現。 如果線性范圍重疊，則確定要加載的樣品量也同樣容易。 然而，如果范圍不重疊，如評估高表達的看家基因相關聯的低豐度蛋白是非常常見的，定量就變得很困難。 此外，如果你感興趣的蛋白被刺激上升或下調，那么這可能會進一步干擾您嘗試適應線性范圍。

如果你的線性范圍不重疊，我們該怎么辦？

但是，有幾個辦法可用。 經常被忽視的步驟是改變上樣質控。 如果您知道您的蛋白質表達水平相對較低，則上樣控制選擇如beta-actin蛋白可能不合適。 在這些情況下，使用細胞器特異性蛋白質可能會更有益，如Lamin B1或HSP60，因為它們應該表達不是特別高，但是應注意確認這些蛋白是表達不會因為處理而發生改變

第二個選擇是從單一內參上樣質控轉向總蛋白定量，作為質控的一種手段。 通過評估整個蛋白范圍，產生更廣泛的動態范圍。 這些染色包括凝膠和膜染色，并且可以以各種不同的方式成像。 此外，如前所述，該技術是檢查蛋白分離質量和轉印效率非常好方法。

最后，可以在成像期間擴大動態范圍。 膠片動態范圍很差，曝光時間不準確的問題可能會使事情變得更加復雜。 凝膠和膜在成像系統里面進行成像，如我們的c系列。 諸如c600的成像系統和Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統能夠在更寬的動態范圍內進行成像，因此能夠進行線性范圍的檢測。