Azure Biosystems Western blotting之實驗秘籍
蛋白分離、雜交、檢測、分析
前瞻回顧
鑒于小編在《Azure Biosystems Western Blotting工作流程之實驗方法的選擇》中和大家聊了Western blot的實驗方法選擇，相信大家已經將您的western blot 實驗方法選擇好了，那么這期小編和大家聊聊western blot的實驗流程中的那些事。
蛋白分離
電泳準備？
玻璃配膠板要清洗干凈，以免引起配膠問題，影響蛋白分離
配膠液要充分混勻，凝聚時間要夠，如膠凝聚不均勻，會造成膠分辨率差。出現笑臉皺眉條帶
電泳時，上樣體積和濃度最好保持一致，這樣可以防止出現條帶過寬或者過窄的情況產生
如何選擇膜？
膜上有蛋白質的結合位點，可結合從凝膠中轉移的蛋白質。常用的膜是硝酸纖維素膜（NC膜）和PVDF膜。
NC膜
低分子量蛋白檢測
通常用于化學發光法
蛋白剝離效果不理想
PVDF膜
低表達蛋白結合能力強
通常用于熒光方法（自發熒光背景低）
剝離和二次雜交時，蛋白的截留能力強
如何建立轉膜系統
常用的轉膜系統形式為 “三明治” 結構，凝膠和膜緊密貼合，放在兩張轉印濾紙之間，用電極板夾夾住，置于轉印buffer中，正負電極通電后，將蛋白質從凝膠轉移到膜上。轉印濾紙 （濾紙） 能夠保持均勻一致的壓力，確保膜和凝膠間沒有空隙，并保持轉移buffer充盈在“三明治”結構中蛋白完全從凝膠轉移至膜上。
Blot前準備什么？
當優化轉印設置、條件及實驗時，最重要的是確定樣品中所有蛋白是否從膠上完全轉移到膜上。使用SelfStainTM免染膠來顯示膜上的所有蛋白 ，并立即進行western blot后續步驟。 
膜封閉
封閉目的是防止非特異性結合，降低背景對目的信號的干擾。如使用脫脂奶粉做封閉液，最好將脫脂奶粉進行濾膜過濾，這樣可以減少后期顆粒背景的產生。
一抗孵育
確保新的一抗濃度經過優化。如有確證過的一抗，可嘗試將一抗標記熒光染料，直接進行一步法Western blot檢測。
洗膜和二抗孵育
每次孵育后，洗去多余的抗體對于降低背景信號至關重要。熒光方法Western blot中，洗膜還可以去除有自發熒光的去垢劑。洗膜的時候如果多張，建議分開進行清洗，同時洗膜液體積不能太少。
化學發光檢測
嘗試不同的底物增加靈敏度和信號持久性；化學發光底物使用前需要平衡至室溫，可以增加酶的活性；數字成像系統要靈敏度很高。
熒光檢測
保持所有物品的清潔，確保無背景干擾；印跡膜避光保存；使用背景淬滅板降低背景熒光，增強信噪比。
檢測
Azure Biosystems c系列成像系統
Azure c 系列成像系統提供 4 款性能卓越的 Western blot 成像系統�？梢赃x擇滿足現有實驗需求的型號，當需要提升應用范圍時，通過升級即可完成
分析
AzureSpot分析軟件
AzureSpot 分析軟件作為分析膠和膜的工具，把復雜的分析變得簡單化。
1.在樣品上進行泳道劃分 2.設置閾值，檢測條帶
3.扣除背景，提供有多種背景扣除方法可選
4.查看結果，可作出修改或對任意條帶邊界進行編輯
5.使用標準分子量marker來確定樣品的分子量，或者使用標準品來確定濃度
