組織谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）活性酶偶聯反應光譜法定量檢測試劑盒使用說明

瀏覽次數：3220　發布日期：2017-8-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

組織谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）活性酶偶聯反應光譜法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

組織谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）活性酶偶聯反應光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過谷氨酸丙酮酸轉氨酶和乳酸脫氫酶的酶偶聯反應系統中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法來測定組織裂解樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物組織裂解懸液樣品谷氨酸丙酮酸轉氨酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

谷氨酸丙酮酸轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase；GPT；EC2.6.1.2），又稱為丙氨酸轉氨酶（Alanine transaminase；ALT或alanine aminotransferase；ALAT），存在于各種人體組織和血液中。谷氨酸丙酮酸轉氨酶催化丙氨酸的氨基轉移到α-酮戊二酸（α- Ketoglutarate）的反應，產生丙酮酸和谷氨酸。檢測谷氨酸丙酮酸轉氨酶活性，常用于評價肝功能：GPT活性異常與病毒性肝炎、充血性心衰、肝損傷、膽道疾病、傳染性單核細胞癥有關。基于底物丙氨酸（L-alanine）和α-酮戊二酸，在谷氨酸丙酮酸轉氨酶的催化作用下，轉化成丙酮酸后，通過乳酸脫氫酶系統，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值變化（340nm 波長），來定量分析谷氨酸丙酮酸轉氨酶的活性。其反應系統為：

Alanine aminotransferase/glutamate pyruvate transaminase

α-Ketoglutarate + L-alanine → pyruvate + L-glutamate

Lactate dehydrogenase

Pyruvate + NADH → Lactate + NAD⁺ + H⁺

（高吸收峰）（低吸收峰）

產品內容

清理液（Reagent A） 60毫升

裂解液（Reagent B） 10毫升

緩沖液（Reagent C） 20毫升

反應液（Reagent D） 2毫升

底物液（Reagent E） 2毫升

陰性液（Reagent F） 500微升

產品說明書 1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光譜分析

實驗步驟

樣品準備

手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量
（選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
（選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
移入到一個液氮凍存管
即刻放進液氮罐過夜
次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
放進一個15毫升錐形離心管
加入預冷的500微升裂解液（Reagent B）
轉移到預冷的1.5毫升離心管
強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

測定準備

準備好待測樣品（例如組織裂解萃取懸液樣品等），置于冰槽里
設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零
測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）置入冰槽里融化。緩沖液（Reagent A）在30℃溫度下均衡溫度