采用Ostro 96孔樣品制備板輕松提高DBS萃取物的潔凈程度

Jessalynn P. Wheaton，Erin E. Chambers和Kenneth J. Fountain

應用優勢
  ■ 使用更快的孔內分析方式，更簡潔的單步提取法進行DBS提取
  ■ 去除99.9%磷脂
  ■ 消除磷脂在LC色譜柱中的蓄積，提升方法穩定性

沃特世解決方案
Xevo® TQ-S MS系統
ACQUITY UPLC®BEH C18柱
Ostro™ 96孔樣品制備板

引言
干血斑分析法（DBS）在醫藥行業正變得愈發重要。動物實驗所帶來的經濟及倫理道德方面的問題，以及在運輸以及儲存生物樣品時所產生的高額費用問題，都使得DBS分析法成為一種頗具吸引力的選擇。DBS分析法可取得較高的分析物回收率。然而，該技術在去除內源性干擾方面收效甚微。以殘余磷脂（PLs）為主的干擾物是生物分析中遇到的主要問題。而LC/MS/MS系統中PLs的蓄積，則是引發基質效應的主要原因。在所有其他問題之中，基質效應會以無可預測的方式影響質譜響應值，降低分析方法穩定性并增加其可變性。Ostro 96孔樣品制備板則可消除99%以上的PLs殘留。Ostro 96孔板可通過使用96孔制備板的形式進一步簡化DBS萃取流程，同時提取分析物、去除磷脂、過濾干血斑紙片。DBS樣品可在孔內萃取并稀釋直接進樣到LC/MS/MS系統中。該創新方法能夠顯著降低樣品制備時間，并在萃取轉化、干燥、復溶過程中避免潛在的分析物流失。在本應用紀要中，我們同時應用了傳統方法和Ostro 96孔樣品制備板方法，對含有利培酮、利培酮羥基化代謝物、9-OH利培酮及其內標氯氮平（圖1）的全血樣品進行了萃取。 

實驗部分
ACQUITY UPLC條件
色譜柱：  ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×50 mm，1.7 μm
流動相A：  0.1% NH4OH 水溶液
流動相B：  50/50 ACN/MeOH
流速：  0.6 mL/min
梯度： 

 時間         梯度模式         梯度線型
  (min)             %A    %B
  0.0                75    25           6
  2.0                0.5 99.5         6
  3.0               0.5 99.5         6
  3.1                 75 25            6
  3.5                 75   25            6
進樣量：  40 μL
進樣模式：  部分環進樣
柱溫：  35 ℃
樣品溫度：  15 ℃
強洗針液：  60:40 ACN:IPA＋2% HCOOH
弱洗針液：  95/5 H2O/MeOH

沃特世Xevo TQ-S MS運行條件，ESI+
毛細管電壓：  3.0 V
脫溶劑溫度：  550 ℃
錐孔氣流速：  150 L/Hr
脫溶劑氣流速： 1000 L/Hr
碰撞池壓力：  2.6×10(-3) mbar
MRM通道監測，ESI+參見表1

樣品制備條件
將20 μL的全血樣品滴在未經處理的Whatman DMPK-C血卡上。樣品隨后在室溫下干燥2小時。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm血斑，分別放置進傳統型DBS萃取法所需的1.5 mL離心管和Ostro 96孔板孔中。傳統萃取方法在1.5 mL離心管中進行，使用了250 μL含5%水的甲醇溶液，隨后樣品進行1分鐘渦旋、1分鐘3000 g離心，并最終將萃取物轉移至96孔板上。使用Ostro 96孔板的萃取則采用單步孔內萃取法。在Ostro 96孔板中添加3 mm干血斑（圖2）。以250 μL含5%水的甲醇溶液作為萃取溶液，渦旋操作1分鐘、真空操作5分鐘。兩種方法產生的洗脫液都用250 μL 的水進行稀釋，然后進樣到LC/MS/MS系統中。 

結果與討論
在正離子模式下進行MS分析。鑒于DBS萃取物的直接進樣通常會導致極稀釋的樣品，我們采用Xevo TQ-S以顯著提升系統的靈敏度。這同時也有助于直接進樣，并避免了吹干、復溶過程中可能存在的問題。
針對每一種樣品制備方法，我們都比較了磷脂殘留量。為了達成這一目的，我們對單個試管萃取和使用Ostro PLR板孔內萃取的DBS進行了比對，對五種磷脂進行了量化。與傳統型DBS分析法相比，Ostro板去除磷脂比例高達99.9%（圖3）。為能直觀展示殘余磷脂，傳統型DBS萃取法和使用Ostro的孔內DBS萃取法所產生的五種不同磷脂的總離子流（TIC）如圖所示（圖4）。當使用Ostro板時，磷脂殘留量幾乎可忽略不計，且無蓄積情況。而當使用傳統型DBS法時，即便出于預防磷脂蓄積的目的，采用高比例有機溶劑進行了1分鐘的清洗，磷脂殘余量依舊顯著，而且在整個過程中都有蓄積。我們進行了半驗證，計算QC樣品濃度不足預期值的15%，滿足法規標準。9-OH利培酮（圖6）及其母化合物LLOQ在全血中都達到 0.05 ng/mL。標準曲線在3個以上數量級呈線性，全血中的線性范圍從0.05 ng/mL到50 ng/mL（圖7）。

 結論
  ■ 簡便、單步的DBS樣品制備方法
  ■ 相較于傳統的DBS萃取技術，去除殘余磷脂含量高達99.9%
  ■ 采用Xevo TQ-S質譜儀，獲得高靈敏度
  ■ 去除LC色譜柱中PLs的蓄積

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