三聚氰胺HPLC檢測方法之固相萃取(SPE)法
1. 依據(jù)：GB/T 22388—2008
2. 原理：試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測定，外標(biāo)法定量。
3. 試劑與材料：除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。
3.1甲醇：色譜純；
3.2乙腈：色譜純；
3.3氨水：含量為25％～28％；
3.4三氯乙酸；
3.5檸檬酸。
3.6辛烷磺酸鈉：色譜純；
3.7甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL 甲醇和50 mL 水，混勻后備用；
3.8三氯乙酸溶液（1％）：準(zhǔn)確稱取10 g 三氯乙酸于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用；
3.9氨化甲醇溶液（5％）：準(zhǔn)確量取5 mL 氨水和95 mL 甲醇，混勻后備用；
3.10離子對試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10 g 檸檬酸和2.16 g 辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 水溶解，調(diào)節(jié)pH 至3.0 后，定容至1L 備用。
3.11三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%；
3.12三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（3.7）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃避光保存。
3.13 陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相當(dāng)者。
3.14 定性濾紙。
3.15 微孔濾膜：0.2 μm，有機(jī)相。
3.16 氮?dú)猓杭兌却笥诘扔?/SPAN>99.999％
4. 儀器和設(shè)備
4.1 高效液相色譜（HPLC）儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
4.2 分析天平：感量為0.00001 g和0.01 g。
4.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10000 r/min。
4.4 天津恒奧超聲波提取器。HS,HU系列
4.5 天津恒奧固相萃取裝置。HSE-12D
4.6 天津恒奧氮吹儀。HGC,HSC系列
4.7 天津恒奧渦旋振蕩器。HMS-350
4.8 天津恒奧真空泵。HPD-25
4.9 天津恒奧精密氣體穩(wěn)流調(diào)節(jié)閥。
4.10 具塞塑料離心管：50 mL。
5. 樣品處理
5.1 提取
稱取（液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等）2 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液（3.8）和5 mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于10000 r/min離心30 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。
注：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。
5.2 活化
依次用3 mL 甲醇、5 mL 水活化（3.13）陽離子交換固相萃取柱。旋轉(zhuǎn)固相萃取裝置前的精密氣體穩(wěn)流調(diào)節(jié)閥使洗液流速不超過1 mL/min
5.3 上樣
將5.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（5.2）中。
5.4 淋洗
依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，
5.5 洗脫
用6 mL氨化甲醇溶液（3.9）洗脫，用試管收集洗脫液。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1 mL/min。5.6 濃縮
洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑铮ㄏ喈?dāng)于0.4 g樣品）用1 mL流動相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜后，供HPLC測定。
6. 高效液相色譜測定
HPLC 參考條件
a) 色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者；
C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者。
b) 流動相：C8柱，離子對試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（85+15，體積比），混勻。
C18柱，離子對試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c) 流速：1.0 mL/min。
d) 柱溫：40℃。
e) 波長：240 nm。
f) 進(jìn)樣量：20 μL。
7. 分析
用GB/T 22388—2008標(biāo)準(zhǔn)檢測方法分析，使用天津恒奧的設(shè)備測得樣品的回收率結(jié)果如下：
添加水平（mg/Kg） 回收率
空白
2 116%
4 108%
6 92%
8 96%
由上表可以看出：使用天津恒奧設(shè)備處理樣品，不僅可以提高分析樣品的速度而且還可以得到滿意的回收率。
2. 原理：試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測定，外標(biāo)法定量。
3. 試劑與材料：除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。
3.1甲醇：色譜純；
3.2乙腈：色譜純；
3.3氨水：含量為25％～28％；
3.4三氯乙酸；
3.5檸檬酸。
3.6辛烷磺酸鈉：色譜純；
3.7甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL 甲醇和50 mL 水，混勻后備用；
3.8三氯乙酸溶液（1％）：準(zhǔn)確稱取10 g 三氯乙酸于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用；
3.9氨化甲醇溶液（5％）：準(zhǔn)確量取5 mL 氨水和95 mL 甲醇，混勻后備用；
3.10離子對試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10 g 檸檬酸和2.16 g 辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 水溶解，調(diào)節(jié)pH 至3.0 后，定容至1L 備用。
3.11三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%；
3.12三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（3.7）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃避光保存。
3.13 陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相當(dāng)者。
3.14 定性濾紙。
3.15 微孔濾膜：0.2 μm，有機(jī)相。
3.16 氮?dú)猓杭兌却笥诘扔?/SPAN>99.999％
4. 儀器和設(shè)備
4.1 高效液相色譜（HPLC）儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
4.2 分析天平：感量為0.00001 g和0.01 g。
4.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10000 r/min。
4.4 天津恒奧超聲波提取器。HS,HU系列
4.5 天津恒奧固相萃取裝置。HSE-12D
4.6 天津恒奧氮吹儀。HGC,HSC系列
4.7 天津恒奧渦旋振蕩器。HMS-350
4.8 天津恒奧真空泵。HPD-25
4.9 天津恒奧精密氣體穩(wěn)流調(diào)節(jié)閥。
4.10 具塞塑料離心管：50 mL。
5. 樣品處理
5.1 提取
稱取（液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等）2 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液（3.8）和5 mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于10000 r/min離心30 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。
注：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。
5.2 活化
依次用3 mL 甲醇、5 mL 水活化（3.13）陽離子交換固相萃取柱。旋轉(zhuǎn)固相萃取裝置前的精密氣體穩(wěn)流調(diào)節(jié)閥使洗液流速不超過1 mL/min
5.3 上樣
將5.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（5.2）中。
5.4 淋洗
依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，
5.5 洗脫
用6 mL氨化甲醇溶液（3.9）洗脫，用試管收集洗脫液。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1 mL/min。5.6 濃縮
洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑铮ㄏ喈?dāng)于0.4 g樣品）用1 mL流動相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜后，供HPLC測定。
6. 高效液相色譜測定
HPLC 參考條件
a) 色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者；
C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者。
b) 流動相：C8柱，離子對試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（85+15，體積比），混勻。
C18柱，離子對試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c) 流速：1.0 mL/min。
d) 柱溫：40℃。
e) 波長：240 nm。
f) 進(jìn)樣量：20 μL。
7. 分析
用GB/T 22388—2008標(biāo)準(zhǔn)檢測方法分析，使用天津恒奧的設(shè)備測得樣品的回收率結(jié)果如下：
添加水平（mg/Kg） 回收率
空白
2 116%
4 108%
6 92%
8 96%
由上表可以看出：使用天津恒奧設(shè)備處理樣品，不僅可以提高分析樣品的速度而且還可以得到滿意的回收率。
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