靶向PRTG的CAR-T細胞療法為髓母細胞瘤治療提供新途徑的研究
髓母細胞瘤是兒童中最常見的惡性腦腫瘤之一，起源于人類胚胎期的后腦。根據分子特征可將髓母細胞瘤分為四個亞型：SHH、WNT、group 3（Gr3-MB）和group 4（Gr4-MB）。其中，Gr3-MB亞型預后較差，在診斷時頻繁出現轉移，但其背后的細胞和分子機制尚不明確。
在一項新研究中，多倫多病童醫院、匹茲堡大學醫學院等機構的研究人員從人類胚胎后腦中鑒定出一個干細胞樣群體，該細胞群體啟動并維持了Gr3-MB腫瘤。這項研究成果發表在《Cell》雜志上，有望為Gr3-MB患者的治療帶來新途徑。
圖片來源：《Cell》
（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38971152/）
研究材料與方法
研究人員對6例Gr3-MB患者的腫瘤樣本進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），并與四周齡人類胚胎的后腦細胞對比，以確定腫瘤細胞與胚胎細胞的轉錄相似性。他們通過流式分選PRTG+ve和PRTG-ve細胞，通過體外集落形成實驗和體內移植實驗（其中Prtg-cre小鼠由賽業生物提供）來驗證PRTG+ve細胞的腫瘤起始能力。此外，他們還構建PRTG啟動子驅動的白喉毒素受體（DTR）系統，并通過PRTG單克隆抗體和靶向PRTG的CAR-T細胞在小鼠模型中評估治療效果。
技術路線
01 通過scRNA-seq對比Gr3-MB腫瘤和人類胚胎后腦細胞，確定PRTG+ve干細胞為潛在起源
02 闡明PRTG+ve細胞與CD34+內皮細胞形成的神經血管微環境對腫瘤維持的作用
03 利用DTR系統、單克隆抗體及CAR-T細胞，在動物模型中驗證靶向PRTG+ve細胞或其微環境的治療效果
研究結果
1 PRTG+ve干細胞是Gr3-MB的起始細胞/譜系
為了確定Gr3-MB層次結構頂部的細胞，研究人員對Gr3-MB患者的腫瘤樣本進行scRNA-seq，并鑒定出九種不同的轉錄特征。他們隨后分析了四周齡（CS12）人類胚胎后腦的譜系層次結構，發現PRTG+ve/SOX2+ve干細胞位于頂部，PRTG是一種可以抑制神經元分化的跨膜蛋白。
人類大腦發育，包括菱形唇（RL）的空間分區，與其他哺乳動物有顯著差異。人類菱形唇在人類胚胎發育過程中會形成含有SOX2+ve干細胞的腦室區（RLVZ）以及含有Ki67+ve祖細胞的腦室下區（RLSVZ），且兩者之間存在人類特有的中間血管叢（IVP）。他們發現，PRTG+ve細胞定位在菱形唇的RLVZ，表現出MYC高表達和NESTIN低表達。
將Gr3-MB腫瘤的scRNA-seq聚類結果與人類后腦進行比較，研究人員發現大多數Gr3-MB細胞屬于神經祖細胞譜系。然而，一小部分細胞對應于早期神經干細胞（NSC）譜系，包括表達PRTG和SOX2。PRTG在Gr3γ腫瘤中表達最高，該亞型通常伴有MYC擴增、高轉移率和預后不良（圖1）。這些數據表明，胚胎后腦中的PRTG+ve/SOX2+ve/MYChigh/NESTINlow細胞可能是Gr3-MB的起始細胞。
Gr3-MB中的少數細胞在轉錄上類似胚胎后腦中的干細胞[1]
為了驗證PRTG+ve干細胞是Gr3-MB的起始細胞的假設，研究人員從E9.5 PrtgeGFP或Prtg-cre小鼠（由賽業生物提供）的后腦中分離出Prtg+ve細胞，然后與Gr3-MB致癌畸變或對照畸變一起注射到NSG小鼠的小腦中。他們發現，小鼠小腦中的Prtg+ve細胞經MYC激活和Tp53沉默后，可在小鼠中形成類似Gr3-MB的腫瘤。這些結果支持了之前的假設，即人類孕早期后腦發育中的PRTG+ve干細胞是Gr3-MB的起始細胞/譜系。
2 神經血管生態位驅動Gr3-MB腫瘤維持
在正常人類胚胎RLVZ中，PRTG+ve細胞生長在中間血管叢附近，緊鄰著CD34+細胞。在Gr3-MB腫瘤中，PRTG+VE細胞呈現聚集性分布，被豐富的腫瘤血管包圍，而在Gr4-MB腫瘤中未觀察到這種現象（圖2）。在正常人類RLVZ和Gr3-MB中，PRTG+VE細胞均與CD34+VE未成熟血管相鄰，表明血管周圍的生態位支持干細胞維持。
正常和惡性PRTG+ve細胞駐留在血管周圍的生態位[1]
3 靶向PRTG的CAR-T細胞可降低腫瘤負荷
為了確定Gr3-MB的PRTG+ve區室是否是維持腫瘤所必需的，研究人員利用白喉毒素受體（DTR）系統清除了Gr3-MB的PRTG+ve區室。與對照組相比，體內白喉毒素給藥使Gr3-MB移植瘤小鼠模型的生存期顯著延長。治療動物的殘留腫瘤顯示出PRTG表達降低。這個實驗支持Gr3-MB的分層模型，其中頂部的PRTG+ve細胞對腫瘤維持至關重要。此外，PRTG抗體可抑制Gr3-MB細胞活力，使小鼠移植瘤體積縮小。這些結果表明，以PRTG蛋白為靶點的療法有望治療Gr3-MB。
最后，研究人員還構建了靶向PRTG的CAR-T細胞。這些CAR-T細胞在體外可特異性殺傷Gr3-MB細胞。在小鼠移植瘤模型中，他們將CAR-T細胞遞送至側腦室，發現接受LD5-55 CAR-T細胞治療的小鼠腫瘤負荷顯著降低，且生存期比對照組更長。正常兒科組織中缺乏PRTG表達，從而限制了不良副作用。目前還沒有療法獲批用于復發性Gr3-MB，因此靶向PRTG的CAR-T細胞療法成為臨床試驗中值得探索的候選療法。
研究結論
PRTG+ve細胞啟動并維持了Gr3-MB腫瘤[1]
這項研究證實，Gr3-MB起源于人類胚胎早期菱形唇腦室區的PRTG+ve細胞，這些細胞依賴與CD34+內皮細胞形成的神經血管生態位來維持惡性表型（圖3）。靶向PRTG+ve細胞或其微環境的策略（如CAR-T細胞或單克隆抗體）在動物模型中顯示出明顯的療效，為臨床治療Gr3-MB提供了潛在的靶點和方法。未來需要進一步驗證這些策略在人類患者中的安全性和有效性。
參考文獻：
[1]Visvanathan A, Saulnier O, Chen C, et al. Early rhombic lip Protogenin+ve stem cells in a human-specific neurovascular niche initiate and maintain group 3 medulloblastoma. Cell. 2024 Aug 22;187(17): 4733-4750.e26. doi: 10.1016/j.cell.2024.06.011.
