3D生物反應器與微流控芯片的微凝膠培養介紹及相關問題解答
本文開發了一種微流控體外細胞封裝平臺，用于研究 3D 微環境參數對細胞命運的影響。該平臺基于酶交聯的聚乙二醇（PEG）基微凝膠，其機械特性（彈性 300-3000 Pa）、生化特性（如整合素結合肽 RGD）和降解性（含 MMP 底物或非降解肽）可精確調控，成功封裝了成纖維細胞、胚胎干細胞（ESCs）、癌細胞等多種細胞。通過優化（如添加 OptiPrep 調節密度、延長胰蛋白酶處理時間），細胞封裝效率從 20% 提升至60%；為解決細胞逃逸問題，采用雙重封裝策略（微凝膠包埋于非降解凝膠中），實現了長達15 天的長期培養，可觀察細胞活力、增殖和形態變化。該平臺為研究細胞與微環境的相互作用提供了精準工具。
1. 引言
- 背景：3D 細胞培養比 2D 更接近原生微環境，但現有技術難以整合微環境多參數（如 ECM 剛度、可溶性信號）的獨立調控。
- 研究目標：構建基于微凝膠的 3D 細胞培養平臺，實現微環境參數的精準調控，研究細胞對復雜微環境的響應。
CERO 3D細胞(類器官)生物反應器
2. 結果與討論
2.1 微流控細胞封裝
- 材料設計：采用 8 臂 PEG - 乙烯砜（VS），通過凝血因子 XIIIa（FXIIIa）酶促交聯；含 MMP 底物肽（GPQGIWGQ）的微凝膠可降解，含 GDQGIAGF 的為非降解型；RGD 肽促進細胞粘附。
- 微流控裝置：四入口流動聚焦設計，中間通道通入 PEG + 細胞混合液，側通道通入 FXIIIa + 鈣緩沖液及含表面活性劑的礦物油，形成單分散微凝膠（直徑 80-150 μm）。
- 封裝特性：細胞分布符合泊松分布，通過調節初始濃度控制每滴細胞數（0-2 個）；封裝后細胞活力達 90%（PI 染色）。
2.2 封裝效率優化
問題：細胞與培養基密度差異（1.1 vs 1.0 g/mL）導致沉降，1 小時后封裝效率僅 20%。
優化措施：
l 添加 OptiPrep 調節密度：16% OptiPrep（100 μL 培養基中加 16 μL）在 0、30 分鐘時細胞數最多，適配成纖維細胞；癌細胞（MDA-MB-231）和 ESCs 需 20% OptiPrep。
l 延長胰蛋白酶處理：8 分鐘處理減少細胞聚集，結合 OptiPrep 使效率提升至 60%。
問題：細胞與培養基密度差異（1.1 vs 1.0 g/mL）導致沉降，1 小時后封裝效率僅 20%。
優化措施：
l 添加 OptiPrep 調節密度：16% OptiPrep（100 μL 培養基中加 16 μL）在 0、30 分鐘時細胞數最多，適配成纖維細胞；癌細胞（MDA-MB-231）和 ESCs 需 20% OptiPrep。
l 延長胰蛋白酶處理：8 分鐘處理減少細胞聚集，結合 OptiPrep 使效率提升至 60%。
| OptiPrep 濃度（μL/100μL 培養基） | 0 分鐘細胞數 | 30 分鐘細胞數 | 60 分鐘細胞數 |
| 0 | 低 | 顯著下降 | 極低 |
| 8 | 中 | 下降明顯 | 低 |
| 16 | 高 | 較高 | 中 |
| 24 | 中 | 中 | 較高 |
| 32 | 低 | 下降 | 低 |
2.3 防止細胞逃逸
- 現象：ESCs 在 20 小時后開始逃逸，癌細胞也存在類似問題，與微凝膠特性和細胞類型相關。
- 解決方案：
- 方法 1：將微凝膠包埋于 200 μm 厚的非降解 PEG 凝膠（通過 Michael 加成交聯），阻止細胞遷移；但不利于細胞回收。
- 方法 2：微流控雙重封裝（微凝膠再包埋于非降解 PEG 微珠中），結合 16% OptiPrep 使共封裝效率達 40%，實現無細胞逃逸。
2.4 長期培養結果
- 細胞活力：在 5% PEG（40 kPa）外層凝膠中，500 Pa 和 1000 Pa 微凝膠內細胞 15 天存活率較高；10% PEG（100 kPa）外層凝膠因腫脹壓迫，細胞活力顯著下降。
- 細胞增殖：ESCs 在 500 Pa 微凝膠中 4 天內體積增加 3 倍，1000 Pa 微凝膠中增加 2.5 倍且 4 天時有更多細胞死亡。
3. 結論
該平臺實現了微環境多參數的獨立調控，通過優化封裝效率和解決細胞逃逸，可用于長期研究細胞行為。未來可設計可選擇性降解的外層凝膠，以兼顧細胞限制與回收需求。
4. 實驗要點
- 材料：PEG 衍生物（8 臂 PEG-VS、4 臂 PEG-SH）、FXIIIa 酶、RGD 肽、OptiPrep 等。
- 微流控芯片：PDMS 材質，通道深度 100-150 μm，流動聚焦設計。
- 表征：流變學測彈性模量，共聚焦顯微鏡觀察細胞形態，活死染色評估活力。
關鍵問題
該微流控細胞封裝平臺的核心優勢是什么？
核心優勢在于微環境參數的精準且獨立調控，包括：機械特性（通過 PEG 濃度調節彈性 300-3000 Pa）、生化信號（如 RGD 肽介導細胞粘附）、降解性（含 MMP 底物或非降解肽）；同時結合微流控技術實現單分散微凝膠的高效制備，封裝效率可達 60%，并能通過雙重封裝實現 15 天長期培養。
研究中如何解決細胞從微凝膠中逃逸的問題？效果如何？
采用雙重封裝策略：將細胞負載微凝膠進一步包埋于非降解 PEG 凝膠中（薄膜或微珠形式）。非降解凝膠通過小孔徑和高剛度阻止細胞遷移（包括阿米巴運動和間質運動）。結果顯示，該方法可完全阻止細胞逃逸，使細胞在 15 天培養中保持在微凝膠內，且能穩定監測活力、增殖和形態。
該研究對細胞生物學或再生醫學有何潛在應用？
潛在應用包括：系統研究微環境參數（如剛度、生化信號）對細胞命運（如干細胞分化、癌細胞侵襲）的影響；開發高通量藥物篩選模型（基于可控微環境）；優化細胞移植策略（通過微凝膠保護細胞免受免疫攻擊并調控其功能）。此外，平臺的參數可調性為 mechanotransduction（機械傳導）機制研究提供了工具。
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核心優勢在于微環境參數的精準且獨立調控，包括：機械特性（通過 PEG 濃度調節彈性 300-3000 Pa）、生化信號（如 RGD 肽介導細胞粘附）、降解性（含 MMP 底物或非降解肽）；同時結合微流控技術實現單分散微凝膠的高效制備，封裝效率可達 60%，并能通過雙重封裝實現 15 天長期培養。
研究中如何解決細胞從微凝膠中逃逸的問題？效果如何？
采用雙重封裝策略：將細胞負載微凝膠進一步包埋于非降解 PEG 凝膠中（薄膜或微珠形式）。非降解凝膠通過小孔徑和高剛度阻止細胞遷移（包括阿米巴運動和間質運動）。結果顯示，該方法可完全阻止細胞逃逸，使細胞在 15 天培養中保持在微凝膠內，且能穩定監測活力、增殖和形態。
該研究對細胞生物學或再生醫學有何潛在應用？
潛在應用包括：系統研究微環境參數（如剛度、生化信號）對細胞命運（如干細胞分化、癌細胞侵襲）的影響；開發高通量藥物篩選模型（基于可控微環境）；優化細胞移植策略（通過微凝膠保護細胞免受免疫攻擊并調控其功能）。此外，平臺的參數可調性為 mechanotransduction（機械傳導）機制研究提供了工具。
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