犬心絲蟲（Dirofilaria immitis，HMs）單克隆抗體的制備及應(yīng)用

一、犬心絲蟲抗原特性與靶抗原篩選
（一）犬心絲蟲關(guān)鍵抗原蛋白
成蟲抗原（Adult Antigen）
抗原 P（AgP）：成蟲分泌排泄抗原（ES 抗原）中的主要免疫原性蛋白，分子量約 24 kDa，與宿主免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
熱休克蛋白（HSP70/HSP90）：保守性高，參與蟲體應(yīng)激反應(yīng)，免疫原性強(qiáng)。
微絲蚴表面蛋白（MSP）：存在于微絲蚴（L1 期）表面，用于早期感染檢測(cè)。
抗原選擇依據(jù)
診斷應(yīng)用：優(yōu)先選擇成蟲 ES 抗原（如 AgP），因其在感染犬血清中可檢測(cè)到特異性抗體，且與其他絲蟲（如惡絲蟲）交叉反應(yīng)低。

二、抗犬心絲蟲單克隆抗體（mAb）的制備流程
（一）抗原制備與動(dòng)物免疫
重組抗原表達(dá)
基因克隆：從犬心絲蟲成蟲 cDNA 文庫(kù)中擴(kuò)增 AgP 基因，插入 pET 系列原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化 E. coli BL21 (DE3) 菌株。
蛋白表達(dá)與純化：IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，通過 Ni-NTA 親和層析純化重組 AgP 蛋白，SDS-PAGE 驗(yàn)證純度（＞95%），BCA 法測(cè)定濃度。
Balb/c 小鼠免疫方案
初次免疫：重組 AgP 蛋白（50 μg / 只）與弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射。
加強(qiáng)免疫：每 2 周用弗氏不完全佐劑乳化抗原（25 μg / 只） booster，共 3 次；末次免疫前 3 天，尾靜脈注射純抗原（無佐劑）加強(qiáng)。
效價(jià)檢測(cè)：免疫后 7 天采集小鼠血清，間接 ELISA 檢測(cè)抗 AgP 抗體效價(jià)（≥1:10,000 視為合格）。

（二）雜交瘤細(xì)胞構(gòu)建與篩選
脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合
脾細(xì)胞制備：取效價(jià)最高的免疫小鼠脾臟，研磨成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；
細(xì)胞融合：脾細(xì)胞與 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞按 5:1 比例混合，50% PEG1500 誘導(dǎo)融合，接種于 HAT 選擇性培養(yǎng)基，37℃、5% CO₂培養(yǎng)。

陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選與克隆化
初篩：融合后 10-14 天，取培養(yǎng)上清，以重組 AgP 蛋白為包被抗原，間接 ELISA 篩選陽(yáng)性孔。
克隆化：對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞采用有限稀釋法（1 cell/well）克隆化，重復(fù) 3 次，直至單克隆細(xì)胞株穩(wěn)定分泌抗體。

（三）單克隆抗體的制備與純化
腹水制備
預(yù)處理：6-8 周齡 Balb/c 小鼠腹腔注射降植烷（0.5 mL / 只），7 天后注射陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞（1×10⁶ cells / 只）。
腹水收集：注射后 7-14 天，收集腹水，4℃離心（3000 rpm，10 min），取上清。

抗體純化與鑒定
亞型測(cè)定：ELISA 法確定抗體亞型（如 IgG1、IgG2a 等）；
特異性驗(yàn)證：Western blot 檢測(cè)抗 AgP mAb 與犬心絲蟲成蟲提取物的結(jié)合特異性，同時(shí)驗(yàn)證與其他寄生蟲（如犬蛔蟲、鉤蟲）抗原的交叉反應(yīng)。
Protein G 親和層析：腹水經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后，上樣至 Protein G 柱，用甘氨酸 - HCl 緩沖液（pH 3.0）洗脫，立即用 1 M Tris-HCl（pH 8.0）中和，PBS 透析脫鹽。

鑒定指標(biāo)：
三、抗犬心絲蟲單克隆抗體的應(yīng)用
（一）免疫診斷：雙抗體夾心 ELISA 檢測(cè)犬心絲蟲抗原

實(shí)驗(yàn)原理
包被抗 AgP mAb（捕獲抗體）于 96 孔板，待檢血清中的犬心絲蟲循環(huán)抗原（CAg）與捕獲抗體結(jié)合，再與生物素標(biāo)記的抗 AgP mAb（檢測(cè)抗體）反應(yīng)，最后通過鏈霉親和素 - HRP 顯色，OD 值判定陽(yáng)性。

操作流程
包被：捕獲抗體（10 μg/mL）4℃包被過夜，5% BSA 封閉 2 h；
加樣：待檢血清（1:100 稀釋）37℃孵育 1 h，洗滌后加生物素標(biāo)記抗體（1:5000），37℃孵育 1 h；
顯色：TMB 底物顯色 15 min，2 M H₂SO₄終止，酶標(biāo)儀測(cè) 450 nm OD 值（cut-off 值 = 陰性對(duì)照 OD 均值 ×2.1）。

臨床價(jià)值
該方法可檢測(cè)感染后 3-4 個(gè)月的犬心絲蟲 CAg，靈敏度＞95%，特異性＞98%，優(yōu)于傳統(tǒng)微絲蚴檢測(cè)法（需感染 6 個(gè)月后才能檢出）。

（二）免疫層析試紙條（膠體金法）的制備
試紙條設(shè)計(jì)
檢測(cè)線（T 線）：包被抗 AgP mAb（1 mg/mL）；
質(zhì)控線（C 線）：包被羊抗鼠 IgG（1 mg/mL）；
結(jié)合墊：膠體金標(biāo)記抗 AgP 另一表位 mAb（20 μg/mL），干燥后組裝。

檢測(cè)流程
犬血清或血漿滴加至樣品墊，若含 CAg，金標(biāo)抗體與抗原結(jié)合，遷移至 T 線時(shí)被捕獲抗體識(shí)別，形成紅色條帶，C 線顯色驗(yàn)證試紙條有效性。
優(yōu)勢(shì)：10-15 分鐘出結(jié)果，適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，與 ELISA 符合率＞90%。

（三）Western blot 檢測(cè)犬心絲蟲蛋白表達(dá)
應(yīng)用場(chǎng)景
研究犬心絲蟲感染過程中 AgP 蛋白的表達(dá)規(guī)律，或評(píng)估藥物（如伊維菌素）對(duì)蟲體抗原表達(dá)的影響。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)
成蟲或微絲蚴裂解物經(jīng) SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)膜，抗 AgP mAb（1:1000）孵育，HRP 標(biāo)記羊抗鼠 IgG（1:5000）顯色，ECL 曝光后可見 24 kDa 特異性條帶。

四、單克隆抗體應(yīng)用的關(guān)鍵優(yōu)化與挑戰(zhàn)
交叉反應(yīng)控制
犬心絲蟲與貓心絲蟲（D. cati）、惡絲蟲（D. repens）存在部分抗原同源性，需用這些蟲種的抗原驗(yàn)證 mAb 特異性，避免誤診。

抗體穩(wěn)定性改良
免疫層析用 mAb 需經(jīng)耐鹽實(shí)驗(yàn)（如 0.1-0.5 M NaCl）和長(zhǎng)期保存實(shí)驗(yàn)（4℃、37℃加速老化）驗(yàn)證穩(wěn)定性，必要時(shí)通過抗體工程改造（如定點(diǎn)突變）提高熱穩(wěn)定性。

早期感染檢測(cè)的局限性
單克隆抗體檢測(cè) CAg 適用于成蟲感染階段（≥3 個(gè)月），對(duì)微絲蚴期（L1）感染靈敏度較低，需結(jié)合抗微絲蚴 mAb 開發(fā)聯(lián)合檢測(cè)方法。

五、拓展應(yīng)用：犬心絲蟲疫苗研發(fā)與免疫機(jī)制研究
疫苗候選抗原篩選
抗 AgP mAb 可用于篩選能誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，輔助亞單位疫苗設(shè)計(jì)（如重組 AgP 蛋白疫苗）。
蟲體 - 宿主互作研究
通過 mAb 標(biāo)記 AgP 蛋白在蟲體中的定位（免疫熒光或免疫電鏡），探究其在蟲體入侵、免疫逃逸中的作用。

六、總結(jié)
抗犬心絲蟲單克隆抗體憑借高特異性和穩(wěn)定性，在犬心絲蟲病的快速診斷（ELISA、免疫層析）、基礎(chǔ)研究（抗原表達(dá)分析）及疫苗開發(fā)中具有重要價(jià)值。通過優(yōu)化抗體制備工藝和檢測(cè)方法，可進(jìn)一步提升其在犬心絲蟲病防控中的應(yīng)用效能，尤其適用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和臨床早期篩查。