如何用光看清植物健康：葉綠素熒光測定
一、什么是葉綠素熒光測定？
葉綠素熒光測定是通過檢測植物葉片中的葉綠素分子在光照下所發出的熒光來研究植物光合作用效率和健康狀況的技術。葉綠素是植物進行光合作用的關鍵色素，當光照射到葉綠素分子時，能量將主要用于光合作用、熱耗散、和發射熒光。通過測定和分析熒光信號，人們可以深入了解植物的光合作用效率及其對環境脅迫的響應。
圖1 植物葉綠素熒光參數成像示例圖，包括Fm，Fo，Fo’ , FPSII, Fv, NPQ, qN, qP等。
二、測定葉綠素熒光的常見方法有哪些？
目前，測試葉綠素熒光測定分析有四種方法（分別是脈沖幅度調制熒光PAM、快速熒光動力學OJIP、快速重復率熒光FRR、日光誘導熒光SIF），PAM仍是目前最受歡迎和最具影響力的平臺。在使用場景上，PAM適合于實驗室環境，FRR方法也稱為激光誘導葉綠素熒光瞬態，適合于野外連續監測，SIF可以利用光譜儀近地面測量或利用衛星遙感測量等。
三、葉綠素熒光的測定有哪些應用？
葉綠素熒光分析既是室內光合作用基礎研究的先進工具，也是室外自然條件下診斷植物體內光合組織運轉情況、分析植物對環境變化響應機制的重要方法。如今，人們通過葉綠素熒光分析估計量子效率、光合能力，計算光合電子傳遞效率、胞間CO2濃度，并試圖用熒光參數來快速篩選遺傳變異的植物。
四、葉綠素測定過程中常見的光源：
- 測量光：是一種光強度極弱的調制光，幾乎不能引起光系統II反應中心關閉，即全部QA都處于氧化態，此時熒光的產率最低，檢測到的熒光參數為Fo。
- 光化光（或作用光）：用于推動光合作用光化學反應，光強范圍在0-2000 umol·m-2·s-1，可因實驗目的不同而變化。
- 飽和脈沖光：光強通常在5000-10000 umol·m-2·s-1，閃光時長≤1s，確保QA完全處于還原態（即QA-），此時測定的熒光參數為FM或FM’。
- 遠紅光：720-730nm，PPFD為30 umol·m-2·s-1，4 s，測定Fo’之前使用，用于激發PSI而不激發光系統II，促使電子向下游傳遞，推動QA氧化。
五、測定葉綠素熒光的基本步驟是怎樣的？
六、葉綠素測定過程中需注意的問題
1、測定溫度：在20 ℃以下的環境中測定時，由于熒光儀探頭和葉片之間的溫度差會引起探頭表面凝水，造成低估qP值。
2、葉綠體運動：光引起的葉綠體運動會導致高估qN，防止辦法是從作用光中除掉能引起葉綠體運動的光（波長<510 nm）。
3、葉片表面特征：葉片上下表面的特征不同，導致Fv/FM也不相同。
4、暗適應時間的確定取決于實驗目的。如果要得到PSII最大的光化學效率Fv/FM，那最好經過一個黑暗的夜晚，使所有的能量耗散過程全部停止；如果要連續觀察熒光參數的日變化等動態變化，則15-20 min的黑暗即可。
5、熒光參數預期值：
- Fv/FM（C3、C4植物和藻類分別為0.83-0.85、0.78和0.70）
- φPSII（小于Fv/FM的任何值）
- qP和qN（0-1）
- NPQ（一般0-4）
這些數據可以作為測定結果是否可靠的參考。
6、用熒光參數 φPSII計算的光合電子傳遞效率ETRPSII只是一個近似值，可能有多種誤差來源。例如，ETRPSII計算式中的0.84（葉片光吸收的百分數）和0.5（兩個光系統均等地使用葉片吸收的光能）都是假設的，未必符合被測葉片的真實情況，除非通過試驗測定這兩個數值。
7、不可在同一葉片的同一部位過多、過頻地（即兩個光脈沖之間的暗間隔過短）使用飽和光脈沖，否則會導致光合機構的光破壞。
8、葉片熒光測定不可代替氣體交換測定。盡管用葉綠素熒光參數計算光合電子傳遞速率可以估計光合能力，但仍不能代替氣體交換測定。即使同一時刻在葉片的同一部位測定，熒光分析結果和氣體交換結果也多有不同。例如，熒光測定一般反映葉片上層細胞的情況，而氣體交換測定則反映整個葉片包括中下層細胞的情況。
再如，PSII最大的光化學效率Fv/FM對水分脅迫不是很敏感，即使葉片的相對含水量降到50%以下，也很少變化，但此時氣體交換測定的光合速率已急劇降低。因此，若想對葉片的光合功能做出正確估計，最好將這兩種甚至更多的技術同時使用。
