數字PCR與基因編輯育種：番茄基因組倒位頻率檢測助力番茄育種

染色體倒位(inversion)是由于同一條染色體上發生了兩次斷裂，產生的片段顛倒180度后重新連接造成的。染色體倒位現象在植物中廣泛存在，對植物育種來說是有利又有弊。有利之處在于染色體倒位可能改變減數分裂過程中基因的重組頻率，促進物種進化，為生物育種提供了新的策略。不利之處在于倒位也可能對受精和胚胎發育過程產生不良影響，導致生育能力降低或產生遺傳異常的后代。

（圖源：網絡，侵刪）

基因編輯是在植物中誘發或者逆轉倒位突變的有效方法，為修改局部重組率提供了有效機制。最近，荷蘭瓦赫寧根大學的研究團隊在bioRxiv上發布了題為“ Key determinants of CRISPR/Cas9 induced inversions in tomato ”的文章。作者運用CRISPR/Cas9技術在番茄6號染色體上誘導了一系列從1 kb到37.5 Mb不等的倒位，使用數字PCR方法驗證倒位事件的發生，其結果與測序結果高度一致。本文深入探究了CRISPR/Cas9技術誘導染色體倒位的實驗方法和影響因素，為精準育種開辟了新路徑。

應用亮點：

• 首次系統地探討了CRISPR/Cas9在番茄中誘導基因組倒位的關鍵機制，揭示了不同因素對倒位發生頻率和類型的影響。

• 創新性地應用naica®微滴芯片式數字PCR系統對CRISPR/Cas9誘導的基因組變化進行高靈敏度和定量分析，為監測基因組編輯結果提供了更為精準的工具。

實驗結果：

⒈ 倒位片段長度與倒位誘導頻率的關系：作者設計了十三個CRISPR/Cas9構建體，每個構建體含有兩個靶向番茄染色體6特定位點的gRNA，一個是固定的參考gRNA，另一個是可變gRNA。通過這些構建體誘導了一系列1 kb到37.5 Mb不等的倒位，發現倒位大小對誘導頻率的影響微乎其微，除非大于1Mb的倒位。對于長片段的倒位，無論gRNA切割效率如何，其倒位頻率都會大幅地下降。作者提出了假設，長片段倒位形成的頻率較低可能是因為這些片段運輸到修復部位的過程中，受到其尺寸的阻礙。

▲圖1，使用固定gRNA的平均突變頻率對轉染效率進行校正后得到的可變gRNA突變頻率(%)（縱坐標）

⒉不同方法驗證：作者將CRISPR/Cas9構建體轉染到原生質體中，利用naica®微滴芯片式數字PCR系統 (cdPCR)鑒定倒位事件。同時，利用Hi-Seq測序技術檢測了固定和可變gRNA靶點上雙鏈斷裂(DSB)位點的突變（1kb-3kb），進一步驗證突變和倒位事件的發生的頻率。這種雙重方法能夠將倒位頻率與突變誘導頻率聯系起來。結果發現，兩種檢測技術的結果高度一致，檢測的倒位頻率相當。

▲圖2c：naica 數字PCR微滴質控圖，藍色圈表示陽性微滴，代表倒位事件的發生

▲圖2b：通過PacBio Sequel II測序(綠色)和cdPCR (藍色) 檢測到的1kb和3kb大小的倒位事件頻率

⒊ 修復機制：作者假設了植物細胞內可能存在一種未被完全理解的非同源末端連接（NHEJ）修復機制，利用受損染色體部分的主動運輸到細胞核中的專用修復位點來完成修復。

⒋ 倒位頻率的瓶頸：作者發現，可變gRNA的切割能力較低時，倒位的頻率也將下降，可變gRNA的切割能力可能是誘導倒位的關鍵因素。

結論：

倒位事件在細胞群體中的發生頻率通常較低，長片段（如超過1 Mb）倒位事件頻率更低。cdPCR較傳統PCR方法，具備更高靈敏度，使其能夠檢測到這些低頻事件。研究團隊使用cdPCR檢測到的倒位事件與PacBio Sequel II測序數據高度一致，驗證了cdPCR在倒位檢測中的可靠性。這項研究不僅增進了我們對基因編輯過程中染色體結構變異的理解，也為植物育種提供了新的策略，通過調控倒位頻率，可以更精準地改良作物特性，培育出更優質的番茄品種。

參考文獻：
Jillis Grubben, Gerard Bijsterbosch, Richard G.F. Visser, Henk J. Schouten. (2024). Key determinants of CRISPR/Cas9 induced inversions in tomato. bioRxiv. doi:10.1101/2024.01.09.574821