客戶聲音：全光譜激光共聚焦成像系統，實時熒光壽命成像不二之選
編者說
大型科研儀器是科研實現原創性突破的利器，開放共享開辟了科技創新的新賽道。為促使我校大型儀器共享與服務水平上一個新的臺階，讓“器”的投入最終在“智”上顯出更廣更大的效應和價值，實驗室與設備管理處微信公眾號將陸續推出“大儀說”系列報道，旨在幫助校內外用戶深入了解學校大型科研儀器設備，促進共享與合作。
大儀速寫
傳統激光共聚焦顯微鏡以單譜線激光器作為光源，利用不同熒光探針標記生物樣本內不同組分，分析熒光強度參數實現較高的成像對比度和特異性，但檢測結果易受熒光團濃度、激發光強度、光漂白等因素影響。熒光壽命成像技術（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）不受激發光強度、熒光團濃度、光漂白等因素影響。熒光壽命與熒光團所處的微環境密切相關，能反映微環境中pH、折射率、離子濃度等變化，是熒光團的固有屬性。通過測量熒光壽命可精準定量不同樣本或實時分析處于不同狀態的生物樣品，獲得與熒光光譜技術、熒光強度檢測技術互補的結構與功能信息。熒光壽命測量系統基于激光掃描共聚焦顯微系統（LSCM）的搭建，熒光壽命成像變得高效且簡單。
圖1. 小鼠胚胎的熒光壽命圖像
圖示短壽命藍色，中等壽命黃色，長壽命為橙色和紅色。722個視野拼接，擬合出4個獨立的特征壽命，采集時間約1小時，傳統方法約1天。
與傳統激光共聚焦顯微鏡相比，全光譜激光共聚焦激發端可在440-790nm波段內任意調節，檢測端可在410-850 nm內接收熒光信號，激發光和熒光得到精準最高效的利用，實現了對目前市面上多數近紅外染料標記成像的需求。因其激發與發射光譜的自由設置，染料可自由選擇，輕松實現特殊染料成像、多色成像、光譜近似的染料成像區分、目標標記和自發熒光成像區分等多種普通共聚焦無法實現的高端實驗。
圖2.多色熒光成像（7色）
圖示由醫學院公共技術平臺組織形態學分平臺提供的多標記腫瘤組織，七色成像，精準獲得不同標記的位置和形態信息。
浙江大學醫學院公共技術平臺引進的全新全光譜高分辨激光共聚焦成像系統（Stellaris 8 Falcon），一改傳統共聚焦固定譜線的激光激發成像模式，基于靈活設置的激發端和高靈敏的檢測端，不僅實現了高分辨率的快速共聚焦多色成像、近遠紅染料成像等，更是理想的壽命成像和分析設備，在生物醫學研究中具有較大的應用潛力。
圖3. 全光譜高分辨激光共聚焦成像系統（Stellaris 8 Falcon）
大儀零距離
該設備的工作原理是什么？
該設備基于倒置激光共聚焦顯微鏡，集成了全光譜連續可調脈沖激光器激發系統，搭載精準光子計數模式高靈敏混合探測器（HyD），不僅可實現強度成像，也讓熒光壽命成像變得高效且簡單。
熒光壽命是指分子停留在激發態的平均時間ns。通過觀察足夠大量的激發-發射事件集合來測量熒光染料的典型壽命。測量圖像中所有像素平均光子到達時間，即熒光壽命成像(FLIM）。熒光壽命范圍一般在0.2-20ns之間，反映了熒光分子內在屬性和所處微環境。
圖4. 熒光壽命成像原理
在功能上有什么獨特性和先進性？
1）熒光強度測量。配備自由連續可調脈沖白激光器，擁有351根激發譜線，可同時分離8根激光譜線；加上超高靈敏度熒光檢測范圍達850 nm的檢測器。自由選擇染料并同時8色成像，輕松實現一些特殊染料或近紅外染料的快速成像。
2）熒光壽命測量。實現視頻速率的快速熒光壽命成像，可用于監測代謝狀態和微環境變化、分子間快速相互作用(FLIM-FRET)、膜張力研究（Flipper-TR）、不同壽命組分高效拆分等。
熒光壽命檢測模塊和共聚焦的整合，既能做最基礎的單光子共聚焦成像，又能實現高分辨的高精度特殊多色成像。可在亞細胞水平上檢測Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。同時具備FLIM熒光壽命成像功能支持多種應用。
該設備是目前功能極為全面的全光譜激光共聚焦成像系統。具備FLIM熒光壽命成像模塊、Lightning高分辨成像模塊、共聚焦常規模塊（3D、時間、多點、光譜掃描、大視野拼圖）和活細胞孵育系統，除了完成細胞或組織內熒光信號的檢測外，還可開展FLIM熒光壽命成像，FLIM-FRET、組分分析分離、局部離子濃度、微環境(如pH值)、區分光譜近似的染料、區分染料和自發熒光等多種普通共聚焦無法實現的高端實驗。
在傳統熒光強度和熒光光譜兩個維度的基礎上，又增加了熒光壽命這一新的成像維度，大大拓展了該系統在細胞生物學、生物化學、生理學、神經生物學等眾多學科中的應用。
在功能成像領域中，監測小分子、離子或電勢的動態變化，通常是用熒光探針來完成，其中多數顯示出強度和壽命的變化。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質，并在活細胞中表達這些構建體。最為現代化的工具是蛋白質或肽，它們與所需的分析物（如Ca2+）結合，并裝飾有一對進行FRET的熒光蛋白。結合分析物后，肽發生構象變化，FRET將出現或消失。這些探針被稱為FRET-生物傳感器。生物傳感器的一種是利用cAMP結合蛋白Epac。
圖5. FRET跟蹤活細胞中的分子相互作用
圖示用游離態的cAMP刺激培養細胞，并用Epac FRET-生物傳感器進行監測。在紅色圓圈區域分析信號（平均到達時間tₐ）。隨時間變化的圖示見底部。由K.Jalink，B.van den Broek，NKI Amsterdam(NL)提供。
FALCON的計數速度足夠快，可在活細胞中使用化學傳感器和FRET生物傳感器進行熒光壽命成像。無染色應用是分析活體材料中的內源性熒光。例如：癌細胞抑制細胞呼吸，傾向于無氧糖酵解（瓦博格效應），這會導致積累更高濃度的熒光NADH。即使沒有活檢，多光子顯微鏡也能在皮膚組織中進行深度成像。同樣，壽命對比度要可靠得多，因為深層的顯微鏡會受到吸收和陰影效應的影響，從而使強度信號失真。
傳統意義上，不同的熒光染料以其不同的顏色來區分。如果激發和發射相同，仍可通過壽命進行區分。發射強度和壽命可以作為顏色的函數獨立記錄。因此，可見熒光染料的數量是發射光譜和擬合壽命的乘積。
圖6. lt-染料分離的原理證據（6個信號）
圖示用480 nm激發云杉葉的新鮮切片，在兩個通道（頂部和底部行）中進行記錄，每個通道可分開顯示三個壽命（從左到右）。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持。
這臺設備開放共享情況如何？可以通過什么途徑聯系使用它？
全光譜高分辨激光共聚焦成像系統自2023年6月引進正式投入使用以來，已服務浙江大學醫學院、藥學院、生命科學學院、農業與生物技術學院、化學工程與生物工程學院、附屬醫院等校內外多家單位，累計機時近兩千小時，培訓師生近百人。未來，我們希望繼續提高設備利用率，加強開放共享，更好的服務廣大科研用戶，期待與更多單位開展合作研究。
如果需要使用這臺儀器，可登入浙江大學醫學院公共技術平臺網站或聯系楊老師進行預約。
醫學院公共平臺網址：
https://www.cfzsm.zju.edu.cn
聯系方式：
楊老師 0919304@zju.edu.cn
0571-88206765
內容來源：醫學院公共技術平臺
今日編輯：張雨樓
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