阿爾茨海默癥(AD)機制研究中的組織及細胞光學成像（下篇）

阿爾茨海默�。ˋlzheimer's disease, AD），俗稱“老年癡呆癥”，是一種嚴重的神經退行性疾病，患者通常會出現以記憶力衰退、學習能力減弱為主的癥狀，并伴有情緒調節障礙以及運動能力喪失，極大地影響個人、家庭乃至社會的發展。目前，全球約有5000萬人罹患AD。隨著人類平均壽命增長、老齡化社會加劇，AD患病率也將不斷上升，預計到2050年AD患者將增加至1.5億以上。已有研究表明AD發病與代謝性改變相關，且AD具有很強的遺傳性。目前仍缺乏預防或治療AD的有效方法。組織及細胞相關的各類光學成像技術的應用有助于AD病理學特征檢查、揭示病因機制，從而探索開發新的治療策略。

以下將與大家分享徠卡Cell DIVE和LMD產品在研究AD蛋白質組學中的應用。

►應用Leica Cell DIVE多重成像進行AD疾病腦空間蛋白質組學分析

Cell DIVE多重成像結合Cell signaling Technology的IF/IHC 驗證抗體，圍繞AD的病理標志，檢查突觸及細胞的空間位置，并分割和聚類分析識別空間共定位的細胞群，例如疾病相關的小膠質細胞標志物定義的細胞亞群。通過細胞類型特異性標記結合多重組織成像，進一步了解人類大腦的空間異質性。

 

實驗方法：

CST抗體經過嚴格的驗證過程，以確保在FFPE組織上的性能。本研究中所有抗體均為直接偶聯抗體。（表格1）

組織從商業來源獲得 (BioChain，表格1) 。

成像：在Cell DIVE成像儀上使用四個通道加DAPI對載片進行成像，自動對焦，自動校正和拼接。圖像采集在2周內進行。

圖像分析：使用AIVIA 13導入、融合和分析拼接圖像。應用AI驅動的模塊，對蛋白表達進行量化、表型分析。

圖4.1 A .成人對照和B. 成人阿爾茨海默病腦切片的多重成像，顯示了15個生物標記物。C. 上: 神經元標記物的空間定位 ，以了解AD大腦外周與內部表達的異質性；下圖：通過像素分類器來分割AD腦中的所有表型標記。D.以星形膠質細胞(GFAP、S100B)、小膠質細胞(TMEM119、IBA1)、成熟神經元(Enolase2)和阿爾茨海默病相關標志物(TauGT-38、p-Tau217、P-Tau181和β-淀粉樣蛋白)特異性標志物表達為特征的細胞表型。DAPI顯示為藍色。E. β-淀粉樣斑塊橫截面積(大小)直方圖。F.量化面積比，以估計阿爾茨海默癥大腦中標記物表達與對照組相比的百分比變化。

圖4.2了解阿爾茨海默病大腦的神經元空間布局。A . AD大腦中所有神經元成分的相關圖，熱圖中顯示了所有測量值對之間的Pearson相關系數。B.與阿爾茨海默癥斑塊相關的空間圖像。箭頭表示β -淀粉樣蛋白陽性斑塊段，20 um寬徑向圓顯示斑塊周圍聚集的鄰近細胞類型，標記為GFAP+， S100B+， TMEM119+和IBA1+細胞。C.基于β -淀粉樣蛋白斑塊大小的AD大腦周圍的聚類揭示在較大斑塊周圍的幾個細胞群的富集以及基于與β -淀粉樣斑塊的相對距離，已確定的表型聚類。左下：基于與斑塊相對距離編碼的GFAP+細胞分割的代表性圖像。

圖4.3杏仁核中AD相關標志物。AD杏仁核中神經原纖維纏結(洋紅色)、斑塊中β淀粉樣肽Aβ沉積(白色)和GFAP+(綠色)星形膠質細胞的定位。人AD大腦杏仁核內側核相對沒有神經原纖維纏結和β斑塊。在杏仁核的其他區域，如AD大腦的副基底區，纏結和β斑塊明顯上調。

►應用徠卡激光顯微切割LMD研究AD和輕度認知障礙MCI患者腦淀粉樣血管病蛋白質組的差異

腦淀粉樣血管病(CAA)以Aβ沉積在腦血管系統為特征。AD則和老齡化、腦出血有關，并導致認知障礙。為了更好地了解分子機制，我們從年齡匹配的對照組(n=10)、輕度認知障礙(MCI，n=4)，散發性AD (n=6)，利用LMD特異地分離病理組織，然后進行無標記定量質譜分析。

樣本及免疫組化(IHC)：

FFPE 8um切片，放在PET膜玻片上，二甲苯和乙醇洗滌再水化，0.3% H2O2中孵育20分鐘，在10%山羊血清中封閉1小時，用4G8一抗(1:1000,biolgend #800711)在4℃下孵育一夜，洗滌后在生物素化小鼠二抗(1:1000,Vector實驗室)中孵育1小時，然后用親和生物素過氧化物酶(Vector實驗室)孵育1小時。切片用DAB溶液(ThermoFisher)孵育10分鐘，隨后用蘇木精(Sigma #MHS16)反染，并在封閉容器中風干過夜。

LMD切割：

從n=10例對照 CAA(-)、n=4例MCI [CAA(+)和CAA(-)]和n=6例AD [CAA(+)和CAA(-)]病例中，以每例2 mm2的一致面積將灰質中有管腔和血管壁的血管顯微切割到質譜級水中(Thermo Scientifc)。包括大血管和毛細血管，不含輕腦膜和白質中的血管。14000 g離心2 min，80℃保存。以上使用Leica LMD6500 10倍物鏡完成樣品切割。

圖5.切割CAA(+) (Aβ陽性)血管和CAA(-) (Aβ陰性)血

深入理解大腦疾病的空間異質性，可通過多重免疫熒光組織成像的方式獲取更多空間蛋白的相關信息，Cell DIVE專利的循環染色方法和經驗證的370+抗體庫將會是您研究的得力工具。

LMD作為組學研究中樞，可以和其他空間成像技術相輔相成，并結合AI識別，提供從組織到單細胞水平樣本的分離收集，為下游發現新的biomarker、藥物靶標開發，疾病分型診斷、精準醫學提供新觀點。

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參考文獻：

1. Spatial Proteomic Analysis of Alzheimer’s Disease Human Brain using Multiplexed Imaging.

2. Differences in the cerebral amyloid angiopathy proteome in Alzheimer’s disease and mild cognitive impairment. Acta Neuropathologica (2024) 148:9.