抗體FC驗證應用實驗細胞染色步驟詳解

一、細胞表面染色操作流程

①細胞計數(shù)

細胞計數(shù)：將培養(yǎng)好的細胞收集于15mL離心管并計數(shù)；500g離心4min，去上清。

②制備單細胞懸液

將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細胞懸液。

③（可選）阻斷Fc受體

室溫孵育10-20min。

④一抗孵育

每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應30min。

⑤洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

⑥二抗孵育

對于非熒光染料直標抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟8。

⑦ 洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

⑧重懸細胞

用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。
 

二、細胞胞內(nèi)染色操作流程

①細胞計數(shù)

將培養(yǎng)好的細胞收集于15mL離心管并計數(shù)；500g離心4min，去上清。

②制備單細胞懸液

將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細胞懸液，400g離心5min去上清。

③固定

每孔加入100μl細胞固定劑重懸細胞，2-8°孵育20min。

④洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

⑤洗滌

每孔加入100μl細胞通透劑重懸細胞，室溫孵育20min。

⑥洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

⑦ (可選）阻斷Fc受體：

10-20min。

⑧一抗孵育

每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應30min。

⑨洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

⑩二抗孵育

對于非熒光染料直標抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟11。

⑪洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

⑫上機分析

用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。
 

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