naica®微滴芯片數(shù)字PCR在霍亂弧菌耐藥性機制分析的應(yīng)用

導(dǎo)讀

自青霉素發(fā)現(xiàn)以來，抗生素已經(jīng)成為人類對抗細菌的最有效武器，挽救了無數(shù)人的生命，但隨著抗生素使用上的無節(jié)制，抗生素耐藥性已成為一個重大的全球問題。因此了解微生物對抗生素適應(yīng)的分子機制成為抗擊抗生素耐藥性（AMR）的一個重要途徑。

近日，法國巴斯德研究所的科學(xué)家運用轉(zhuǎn)錄組測序、naica^®微滴芯片數(shù)字PCR等技術(shù)證實VchM（霍亂弧菌特有甲基轉(zhuǎn)移酶）參與應(yīng)對氨基糖苷類抗生素的應(yīng)激反應(yīng)，這表明，DNA甲基化在氨基糖苷類抗生素的耐藥機制中也發(fā)揮著重要作用，該文章刊載于《PLOS GENETICS》。

應(yīng)用亮點：

▶  運用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)分析霍亂弧菌操縱子表達情況。

▶  VchM缺失會導(dǎo)致生長缺陷，但卻可以使霍亂弧菌對氨基糖苷產(chǎn)生應(yīng)激。

▶  VchM直接調(diào)節(jié)groES-2（伴侶蛋白編碼基因）的胞嘧啶甲基化，從而改變其表達情況，影響霍亂弧菌耐藥性。

氨基糖苷（AGs，如：妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和新霉素）是一類針對細菌核糖體小亞基的抗生素，其破壞翻譯保真度，增加細胞中錯誤折疊蛋白質(zhì)的水平。而本文的研究主要針對霍亂弧菌對其的耐藥性機理。科學(xué)家們在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，特定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因突變（VchM）的霍亂弧菌相比WT具有更強的耐藥性，這表明DNA甲基化可能在霍亂弧菌適應(yīng)AGs中發(fā)揮作用。

VchM編碼一種Orphan m5C DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)致5‘-RCCGGY-3’基序的胞嘧啶甲基化，雖然VchM的缺失會導(dǎo)致生長缺陷，但霍亂弧菌細胞可以在亞致死濃度和致死濃度的抗生素下對氨基糖苷應(yīng)激。

▲圖1：霍亂弧菌ΔVchM對亞致死濃度氨基糖苷的敏感性較低。GAs類，TOB（妥布霉素），0.6 μg/ml、GEN（慶大霉素），0.5 μg/ml、NEO（新霉素），2.0 μg/ml；非Gas類，CAM（氯霉素），0.4 μg/ml和CARB（β -內(nèi)酰胺類西林），2.5 μg/ml

對于ΔVchM霍亂弧菌的轉(zhuǎn)錄組測序和遺傳分析發(fā)現(xiàn)，ΔVchM菌株中有4個直接參與蛋白質(zhì)折疊的基因被上調(diào)。包括groEL-1，groEL-2，groES-1，groES-2。

通過naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對基因表達進行驗證分析發(fā)現(xiàn)，ΔVchM霍亂弧菌中g(shù)roES-2的表達在不同時期均有較大上調(diào)。進一步通過缺失驗證表明了groESL-2對ΔVchM的抗生素高耐受性的作用。

▲圖2：ΔVchM菌株中g(shù)roESL-2操縱子上調(diào)(對數(shù)生長期，Exp, OD600 ≈ 0.3；指數(shù)生長期，Stat, OD600 ≈ 1.8–2.0)

在groESL-2區(qū)域觀察存在四個VchM甲基化基序存在。進一步對基序分析發(fā)現(xiàn)，破壞這些基序會導(dǎo)致groESL-2基因表達增加（如圖3）。且基序破環(huán)越多，則導(dǎo)致的表達上調(diào)更加明顯。同時，ΔVchM中的groESL-2基因表達一直高于基序突變，表明還存在其他因素與甲基化協(xié)同控制groESL-2表達。這些結(jié)果表明，在霍亂桿菌中，一組特定的伴侶蛋白編碼基因受DNA胞嘧啶甲基化的控制，將DNA甲基化與伴侶蛋白表達的調(diào)節(jié)和對抗生素的耐受聯(lián)系起來。

▲圖3：在WT中，groESL-2區(qū)域的VchM位點突變導(dǎo)致基因表達增加

法國巴斯德研究所是世界上最著名的研究所之一，成立130余年來一直走在世界科技前沿，是微生物學(xué)、免疫學(xué)、傳染病學(xué)等學(xué)科的起源地，曾開發(fā)出狂犬病疫苗、天花疫苗、流感疫苗、黃熱病疫苗等多個造福人類的疫苗產(chǎn)品，并培養(yǎng)了10名諾貝爾獎生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者，實現(xiàn)研究、教育、健康、創(chuàng)新“四位一體”的研究機構(gòu)。