干貨分享：光纖記錄實驗手術操作流程與超詳解析
光纖記錄系統作為常用的研究動物神經元活動與行為關系的重要工具，對于研究特定神經環路在不同行為范式中的功能具有重要意義。本文將著重介紹光纖記錄實驗手術所需器材，手術步驟以及注意事項，助力實驗數據準確性的提升。
實驗設備和材料
異氟烷麻醉系統、立體定位儀、數碼顯微鏡、電極拉制儀、微量注射泵、剃毛工具、手術刀、眼科鑷、眼科剪、棉簽、碘伏、3%雙氧水，AAV病毒、陶瓷插針、顱骨鉆、鉆頭（0.8mm）、顱釘（M1.0xL2.0mm）、螺絲刀（45*1mm）、生理鹽水、牙托粉水（義齒基托聚合物，自凝型）、紅霉素眼膏、抗生素等。
術前準備
01
確定目標腦區坐標
確定目標腦區位點通常有兩種策略：
- 通過使用立體定位圖譜，尋找目標腦區具體位置，讀取目標腦區深度，矢狀、冠狀坐標，最終確定目標腦區的三維坐標。
- 通過閱讀參考文獻，獲取方法中涉及目標腦區的坐標。文獻中坐標常用標注：AP：anteroposterior，前囟前后；ML：mediolateral，中縫左右；DV：dorsoventral，顱骨（硬腦膜）平面向下。
*需要注意：文獻中坐標選取的Z軸參考點：包括Bregma點、腦膜表面、顱骨表面的Z軸讀值
02
器具消毒、儀器檢查
實驗前使用酒精擦拭手術器械，檢查各種實驗耗材是否準備完整。檢查立體定位儀，確保定位儀刻度置零，可以正常工作。
03
實驗動物準備
選取實驗動物檢查其健康狀況。
（▲小鼠顱骨表面示意圖）
動物手術
01
動物麻醉及固定
- 小鼠稱重。
- 在異氟烷誘導盒中麻醉小鼠（4％，1 L / min）。
- 將小鼠嘴部放在麻醉面罩中。
- 將小鼠門齒扣在適配器齒棒上，并使用適配器將小鼠固定于立體定位儀上，異氟烷濃度調整為0.5-1%。
- 麻醉深度可通過對腳趾捏合無反應（監測腳趾捏合反應）來確認，手術期間每20min一次。
- 剃掉從眼睛到耳朵后面的毛發。
- 用棉簽蘸少量碘伏清潔頭部。
- 在頭皮表面下注入0.1 ml利多卡因，以提供局部鎮痛作用。
- 保護眼睛避光：涂抹紅霉素眼膏。
（▲手術前小鼠）
02
暴露顱骨
- 從前到后（眼睛之間到顱骨后部）做切口。
- 用蘸有生理鹽水的棉簽擦拭切口。
- 找到并標記Bregma（前囟點）位置。
- 確保頭骨干凈（沒有血液，毛皮或組織）并且干燥（使用干燥的棉簽吸生理鹽水或血液）。
- 將連接好玻璃電極的微量注射泵夾持到定位儀上。
- 調節顱骨水平：玻璃電極針尖接觸Bregma點，將該點設定為原點，而后測量Bregma點左右兩側旁開2.3mm處顱骨的高度差，小于0.03mm則認為左右顱骨水平，大于0.03mm則需要調節耳桿的高度來調整水平，前后方向測量Bregma點和Lambda點的高度差，也需小于0.03mm，若大于0.03mm則上下調整鼻夾的高度（注意：移動顱骨后需要重新定Bregma點）。
- 標記目標位置。
- 在目標標記點處用顱鉆進行開顱并挑開硬腦膜。此外還需鉆兩個預留孔，用于埋植顱釘。如果鉆孔過程發生出血，使用棉簽清潔血液，然后使用一塊可吸收的海綿來止血。
- 用鹽水浸濕的海綿覆蓋開顱部位。
03
病毒注射
- 從冰箱中取出病毒。
- 設置微量注射泵參數（例如吸取體積400nL，速度為800nL/min，模式調為吸入Withdraw）吸取病毒，使其尖端接觸Bregma點并設定原點。
- 取走開顱部位濕海綿。
- 將玻璃電極針移動至目標位點上方，然后下針至目標位點（下針過程保持勻速緩慢），設置注射泵參數（體積400nL，速度40nL/min，模式調為泵出Infuse）,開始注射病毒。
- 注射完成后靜置10min，10min后將微量注射器抬起。
- 瑞沃德R480玻璃微電極注射泵搭配立體定位儀，對腦部可精準進行病毒或示蹤劑注射。
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04
埋植顱釘
顱釘（小螺絲）植入深度約0.5mm左右，避免過深壓迫大腦，過淺固定不牢固。固定顱釘的預留孔需離光纖埋植的位置遠一些，防止顱釘埋好之后留下的空間太小，導致光纖不好埋植。顱骨鉆孔完成后，還需清理顱骨表面的顱骨碎屑，并用生理鹽水清洗，保證顱骨表面清晰干凈。
（▲顱釘植入）
05
陶瓷插針植入
- 在病毒注射后，從腦立體定位儀上取下注射泵。
- 將光纖插針用夾持器固定到腦立體定位儀上。
- 固定光纖之后需要用光纖尖部接觸Bregma點，重新移動至目標位點上方（光纖插針應位于鉆頭產生的窗口上方）。
- 將光纖插針下降到適當的DV坐標，高于病毒注射位置200-300μm。
- 用牙科水泥固定光纖。注意：牙科水泥輕輕涂抹在光纖纖維的底部周圍。
- 待水泥完全凝固后，小鼠轉移至飼養籠中單獨飼養，術后監測健康情況。
光纖記錄實驗
待2-3周鈣熒光病毒表達后，將光纖與小鼠頭部陶瓷插針連接，使用光纖記錄系統采集動物在行為學實驗中大腦的鈣熒光信號，通過分析軟件處理鈣熒光信號數據，并結合行為學視頻對動物的行為進行分析。
（▲光纖記錄實驗）
光纖記錄實驗手術中所需器材、手術步驟和注意事項已全部講解，后續我們還有更多光纖記錄干貨，請持續關注哦~
