基因編輯鼠 sgRNA表達載體構建
在靶點篩選結束之后，下一步就要進行sgRNA載體構建。在構建表達載體前，應根據實驗目的選取合適的表達質粒。比如進行實驗時考慮是否需要reporter標簽，是否需要藥物篩選基因等。
接下來以構建px330質粒為例，具體說明如何構建sgRNA表達載體。（圖1）
-
先確定20bp靶標序列（基因組序列應為20bp+NGG）；
-
如20bp第一個為G，則略過此部分；在20bp前額外添加一個G，形成G+20bp序列（U6 human promoter轉錄時需要起始堿基為G）；
-
在20bp或G+20bp 5’前添加caccg，形成cacc-G+20bp序列，則為Forward序列（直接合成即可）；
-
將20bp或G+20bp 進行反向互補，并在5’前添加aaac，則為Reverse序列（直接合成即可）；
-
合成的sgRNA正反向堿基（摩爾濃度為100μM）進行退火，使之堿基配對并形成雙鏈結構；
-
BbsI酶切px330質粒，并對酶切后的載體進行回收；
-
將退火配對后的sgRNA堿基用超純水按1:200稀釋，并與回收后的載體進行連接；
-
連接產物進行轉化，氨芐抗性固體培養板進行涂板；
-
挑取單克隆菌落，擴大培養后提取質粒，并使用human U6通用引物對連接載體進行測序，檢測sgRNA 堿基片段是否正確插入px330質粒。
圖1.px330 sgRNA表達載體構建示意圖
-
確定20bp sgRNA靶序列，按上述操作將其連接至BbsI酶切的pGS3-T7-sgRNA中，測序并挑選正確插入的質粒；
-
pGS3-T7-sgRNA質粒線性化：用DraI酶切1μg pGS3-T7-sgRNA質粒，37℃反應3h；
-
以構建正確的pGS3-T7-sgRNA為模板，配制體外轉錄反應溶液（體系見表1）；
-
將上述溶液均勻混合后輕微離心，將轉錄反應液收集于反應管底部，42℃反應 2 小時；
-
加3μl RNase-Free DNase I至20μl反應體系中，充分混合后置于37℃反應30min；
-
加77μl RNase-free 純水以終止反應繼續進行；
-
使用酚氯仿和異丙醇方法純化轉錄后的RNA；
-
取反應液的一部分進行4% 瓊脂糖凝膠電泳，確認體外轉錄后的 RNA 產物；
-
測定RNA濃度，用以顯微注射。
圖2. pGS3-T7-sgRNA載體構建及體外轉錄示意圖試劑
用量
Transcription buffer ,10 x
2μl
Template DNA ,200ng/μl
5μl
ATP ,50mM
2μl
GTP ,50mM
2μl
CTP ,50mM
2μl
UTP ,50mM
2μl
Rnase inhibitor ,40U
0.5μl
RNA polymerase , 50U
2μl
RNase-free H2O
2.5μl
表1. sgRNA T7-體外轉錄反應體系
Cas9表達載體體外轉錄步驟。（圖3）
-
pSP6-Cas9質粒線性化：用NotI單酶切5μg pSP6-Cas9質粒，37℃反應5h；
-
0.8%或1%瓊脂糖凝膠電泳，并進行DNA凝膠純化回收，測定濃度；
-
以純化DNA為模板，按mMessage mMachine SP6體外轉錄試劑盒說明書配制反應溶液（體系見表2）；
-
將上述溶液均勻混合后輕微離心，將轉錄反應液收集于反應管底部，37℃反應 2 h；
-
加1μl TURBO DNase至反應溶液中，混勻并在37℃反應15min；
-
加30μl nuclease-free 純水及30μl 氯化鋰溶液，混勻溶液并在-20℃冷凍30min；
-
4℃、14,000g離心10min以沉淀mRNA，小心去除上清溶液。并用500μl 70%乙醇清洗一遍，同時再次4℃、14,000g離心10min；
-
吸凈上清乙醇溶液，室溫干燥5min，最后用20μl RNase-free 純水溶解mRNA沉淀，混勻后置冰上并測定濃度，最后置于-80℃或-150℃保存。
圖3. pSP6-Cas9載體構建及體外轉錄示意圖
|
試劑 |
用量 |
|
Transcription buffer ,10 x |
2μl |
|
Template DNA ,200ng/μl |
5μl |
|
SP6 NTP/CAP ,2 x |
2μl |
|
SP6 enzyme mix |
2μl |
|
RNase-free H2O |
9μl |
表2. Cas9 mRNA SP6-體外轉錄反應體系
參考文獻：
Shao Y et al., CRISPR/Cas-mediated genomeediting in the rat via direct injection of one-cell embryos. Nat Protoc. 2014Oct;9(10):2493-512.
