免疫組化技術發展歷程：從探索到精準醫學的跨越

免疫組化，作為現代醫學和生物學研究中的關鍵技術，其發展歷程見證了人類對生命奧秘不斷探索的腳步。從最初對抗體 - 抗原反應的懵懂認知，到如今成為精準醫學診斷和研究的重要工具，免疫組化的每一步發展都凝聚著無數科研人員的心血與智慧。

一、抗體發現

抗體的發現堪稱生命科學領域的一份珍貴禮物。在人類與疾病抗爭的漫長歷史中，科學家們逐漸認識到抗體在免疫反應中的關鍵作用。隨著研究的深入，人們發現抗體 - 抗原反應會產生沉淀，這一現象引發了科學家們對抗體本質的深入思考。Heidelberger，這位現代免疫學之父，在 1920 年基于氮檢測原理證明了抗體 - 肺炎球菌多糖復合物中含有氮，進而推論抗體可能是一種蛋白質。盡管 Heidelberger 的方法存在一定局限性，無法準確區分檢測到的氮來源于抗原還是抗體，但他的探索為后續研究奠定了基礎。

隨后，Heidelberger 和 Kendall 發明了染色方法，通過使用紫色偶氮染料標記沉淀雞蛋白蛋白，當特異性抗體添加后，抗原 - 抗體沉淀復合物第一次有了顏色，這一突破使得對抗原 - 抗體結構、結合機制的研究得以進一步深入。1934 年，Marrack 提出大部分抗原是多價的，抗體是二價的，他首次在抗體上標記染料，制造了紅色標記的前傷寒和抗霍亂抗體，為免疫組化技術的發展邁出了重要一步。

二、標記技術的興起

標記技術的出現，如同為免疫組化插上了翅膀，使其發展進入了廣闊天地。早期，研究人員使用常規染料對抗體進行標記，但在使用過程中發現存在信號弱的問題。1941 年，微生物學家 A.H.Coons 首次將一種熒光素（異氰酸熒光素）標記在抗肺炎球菌抗體上，可在紫外照射下示蹤小鼠組織中的肺炎球菌，極大地增強了標記抗體的信號，開啟了免疫組化熒光標記的大門。

然而，異氰酸熒光素標記方法操作困難，效果不穩定，如組織在紫外照射下容易有藍色和紅色背景干擾。經過不斷改進，1958 年 Riggs 等制備了穩定的熒光素異硫氰酸酯（FITC）用于標記抗體，實現了穩定性與特異性的增強。FITC 標記原理是 FITC 的氨基 - NH2 與 FITC 中的碳酰胺基 - C = S 相結合，這種標記方法在免疫組化中得到了廣泛應用。

在抗體結構研究的基礎上，人們發現 IgG 可變區有兩個可以與抗原結合的區域，因此標記可以在恒定區進行。FITC 直接標記在抗 IgG 分子的 Fc 片段（恒定區），即直接法，這種方法使得抗體可以直接與組織或細胞中的抗原發生反應，也被稱為一步標記，至今仍在某些領域被使用。

三、技術演進

直接法雖然簡單直接，但存在需要高效價的一抗且成本高的問題。為解決這一難題，研究人員將一抗作為抗原看待，先用一抗 IgG 去免疫體型較大的動物，獲得較多的 Anti - IgG 抗體，然后在二抗上標記，實現放大效果，這就是間接法。

隨著熒光標記免疫組化的發展，到 20 世紀 60 年代，熒光依然在使用，同時也出現了多種常用熒光素，如異硫氰酸熒光素（FITC）、得克薩斯紅（Texas Red）、Cy3、Cy5 等。然而，熒光標記抗體對實驗設施要求較高，需要熒光顯微鏡，且存在熒光淬滅等問題。

為在常規實驗條件下實現免疫組化，19 世紀 60 年代中葉，酶標技術應運而生。酶與一抗或二抗標記，結合后可以特異識別自身底物，顏色產物可在普通顯微鏡下觀察。最初，人們使用堿性磷酸酶作為標記酶，但實驗結果不穩定。1967 年，研究人員找到穩定的辣根過氧化物酶，并對其偶聯技術進行描述。

酶標技術不斷發展，同時免疫電鏡技術也取得進展，放射性和金屬標記被用于抗體標記，如 1959 年 Singer 首先建立了用鐵蛋白標記抗體的方法，使人們在電鏡下對細胞抗原進行精確定位。但酶標技術早期也存在一些問題，如辣根過氧化物酶不能標記所有的抗體，無法解決抗體去除等問題。

為解決這些問題，研究人員提出了三明治法（過氧化物酶三步法），引入用過氧化物酶抗 - 氧化物復合物，原理如下：相當于增加一個過氧化物酶標記點，提高了敏感性。在這一過程中，沒有使用化學偶聯標記，唯一的缺點在于方法的復雜性提升了敏感性和特異性。

1983 年，PAP 技術（Peroxidase - antiperoxidase，PAP）出現，其原理與上述方法類似，但進一步優化了檢測過程。然而，由于抗原 - 抗體反應在洗滌過程中抗體被洗脫的可能性，導致檢測靈敏性降低。1981 年，人們設計了利用生物素和卵白素之間高度親和的特點，產生了親和素 - 生物素復合物法（avidin - biotin complex method，ABC 法），該方法在國內免疫組織化學實踐中主導了 20 多年。

此后，在 ABC 法的基礎上，又發展了 SP、LSAB 及 SABC 法，這些方法的主要特點是用鏈霉菌卵白素或生物素 ABC 法中的卵白素，由于鏈霉菌卵白素或生物素幾乎不與組織中的內源性凝集素樣物質發生非特異性結合，因而產生低背景、高放大與檢測效果，同時避免了與組織內的內源性生物素相結合而產生非特異染色。

四、展望未來

進入 21 世紀，免疫組化技術繼續發展，酶聚合物法在右旋糖酐上用間接法進行染色，其特異性較第一代優于過去的方法，如 EnVision、PowerVision 等方法。關注用作標記物的酶有過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等。酶與 Ig 均為蛋白質，都有較多的氨基，不能直接用臺交聯，必須通過一個交聯劑（3 - CH2）將它的兩個醛基伸出（ - CHO 分別與 IgG 的 NH2 及酶的 - NH2 結合），這樣就把不同的蛋白質連接在一起了。

免疫組化技術從誕生到不斷發展完善，始終圍繞著解決檢測靈敏性、特異性以及操作便利性等問題展開。如今，免疫組化已廣泛應用于腫瘤診斷、病理研究、藥物研發等多個領域，成為精準醫學不可或缺的重要工具。隨著技術的不斷進步，如與分子生物學技術的結合、自動化設備的應用等，免疫組化技術將在未來為人類健康事業做出更大的貢獻，幫助我們更深入地理解疾病的發生發展機制，實現更精準的疾病診斷和治療。