利用11種顏色的光譜分離實現超多標記

利用共聚焦顯微鏡的擴展光譜能力和多色混色工具
熒光顯微鏡是生命科學研究的基本工具，隨著細胞組織和模式生物多色標記策略的發展而不斷發展和成熟。分子特異性標記多種物種的能力需要適當的工具來識別樣品中的多種熒光標簽。

嚴格分離多個標簽對于獲得有意義的成分、豐度、結構和功能讀數至關重要。這種所謂的超多標技術在揭示組織結構、癌癥進展、腫瘤免疫相互作用和傳染病機制等關鍵方面已變得十分突出 [1-4]。

為什么需要超多標？

簡單的多色實驗通常使用三種不同的熒光團，它們在可見光譜的藍色、綠色和紅色區域有不同的發射。然而，生物樣本和過程的復雜性不斷增加，這就在技術和應用方面提出了更高的要求，需要能在中倍數（大于 10 個熒光團）范圍內同時成像的方法 [5-7]。

挑戰

實現多重化的一種方法是使用上述藍、綠、紅熒光團對樣品進行迭代染色和成像。然而，這一過程非常耗時，而且由于每輪染色都需要進行苛刻的處理，可能會影響樣本的完整性和質量。此外，合并數據的圖像處理也很麻煩，尤其是在三維組織樣本中。因此，在更復雜的多重染色應用中，在一輪染色中達到所需的多重染色水平的策略已成為理想選擇。雖然純粹從樣品制備的角度來看，增加樣品中不同熒光團的數量是研究人員可以完成的任務，但如何處理多個熒光團激發或發射光譜的重疊問題，即使對經驗豐富的研究人員來說也是一項挑戰。熒光團的交叉激發和發射光譜的串擾或透射使得區分不同信號變得尤為困難。因此，樣品上每增加一個熒光團，都會增加正確分離每個標簽的難度。

研究方法

STELLARIS 共聚焦平臺就是為這些應用而設計的。下一代 WLL 超連續激發、AOBS、優化的光束路徑和多達 5 個 Power HyD 探測器同時工作，實現了超靈活的光譜能力，確保更大限度地收集來自每個相關標記的光子。 集成在 ImageCompass 用戶界面中的光譜非混合工具使復雜熒光團組合的分離成為可能。 

例如，我們概述了在一輪染色和成像中對 11 種不同熒光團進行成像的一種方法。我們定義了一組光譜不同的熒光團，并通過 STELLARIS 中的線性非混合通道染料分離工具將其分離。為了說明這種方法是如何工作的，我們選擇了11種Alexa Fluor（AF）染料，范圍從AF 405 nm到AF 790 nm（圖1），與鏈霉親和素連接。然后，我們將每種熒光團與涂有生物素的聚苯乙烯珠子耦合，純化珠子，并將它們的混合物裝入 Prolong Diamond 玻璃蓋玻片上。使用配備了 5 Power HyD 檢測器的 STELLARIS 顯微鏡對 11 色樣品進行成像（圖 2）。

圖 1：本文使用的與珠子耦合的 Alexa Fluor 染料的激發光譜（A）和發射光譜（B）。光譜由 FPbase [8] (www.fpbase.org)生成。
圖 2：（A）11 色微珠（標稱直徑 0.8 微米）樣品的原始圖像；（B）利用 STELLARIS 中集成的染料分離工具獲得的圖像。AF 405（藍色）、AF 532（灰色）、AF 594（橙色）、AF 750（青色）、AF 488（淺綠色）、AF 555（黃色）、AF 647（洋紅色）、AF 790（紅色）、AF 514（綠色）、AF 568（紫色）、AF 700（淺黃色）。

為了評估染料分離的效率，我們量化了不同通道中單個珠子上每種熒光團的串擾（圖 3）。在理想情況下，每個珠子只出現在一個通道中，因為我們只用一種熒光團標記它們。為了量化，我們使用了嵌入 Fiji 自動閾值處理功能的最大熵算法 [9] [10]，對每個通道（圖 3B 中顯示為品紅色）的對象（珠子，圖 3A）進行了分割，并測量了所有通道的歸一化平均強度。歸一化平均強度值顯示在直方圖中（圖 3C）。我們的分析證實，每個熒光團都被分配到一個通道，11 個不同標記的珠子可以清楚地分成各自的通道。

圖 3：評估 11 色珠樣品圖像中的染料分離效率。使用染料分離工具成像后獲得的通道（A）使用 MaxEntropy Dark 進行了閾值化和分割（B）。計算不同通道之間的串擾，并繪制每個通道的串擾圖 (C)。

總結
總的結果是成功地對與合成珠耦合的 11 種不同熒光團進行了光譜分離，充分展現了 STELLARIS 共聚焦平臺在進行多重標記分析方面的顯著能力。

參考文獻：
[1] IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Radtke, A. J. et al., PNAS, 2020. doi: 10.1073/pnas.2018488117.[2] Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Stack, E. C. et al., Methods, 2014. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.08.016.
[3] Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Tan, W. C., et al., Cancer Comm (Lond), 2020. doi: 10.1002/cac2.12023.
[4] Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Lewis, S. M.,et al.,  Nat. Methods, 2021. doi: 10.1038/s41592-021-01203-6.
[5] Spectral Imaging and Linear Unmixing in Light Microscopy. Zimmermann, T., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2005. doi: 10.1007/b102216.
[6] Hyperspectral phasor analysis enables multiplexed 5D in vivo imaging. Cutrale, F., et al., Nat. Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4134.
[7] PICASSO allows ultra-multiplexed fluorescence imaging of spatially overlapping proteins without reference spectra measurements. Seo, J., et al., Nat. Comm., 2022. doi: 10.1038/s41467-022-30168-z.
[8] FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Lambert, T. J., et al., Nat. Methods, 2019. doi: 10.1038/s41592-019-0352-8.
[9] A new method for gray-level picture thresholding using the entropy of the histogram. Kapur, J. N., et al., Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 1985. doi:10.1016/0734-189x(85)90125-2.
[10] Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Schindelin, J., et al., Nat. Methods, 2012. doi:10.1038/nmeth.2019.

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