電穿孔介導(dǎo)小干擾 RNA高效轉(zhuǎn)染小鼠胚胎

摘要：
本文詳細探討了電穿孔技術(shù)在介導(dǎo)小干擾RNA（siRNA）高效轉(zhuǎn)染小鼠胚胎中的應(yīng)用。通過優(yōu)化透明帶弱化程度、電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)等條件，結(jié)合不同介質(zhì)作為電轉(zhuǎn)緩沖液，實現(xiàn)了siRNA簡便、高效地轉(zhuǎn)染小鼠附植前胚胎。本研究為基因功能研究提供了有力的技術(shù)參考。

引言：
近年來，小干擾RNA（siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）技術(shù)已成為研究基因功能的重要工具。siRNA通過特異性降解靶mRNA，抑制其表達，從而實現(xiàn)基因沉默，為研究基因在生物體發(fā)育和疾病發(fā)生中的作用提供了強有力的手段。然而，將制備好的siRNA導(dǎo)入細胞中是一個技術(shù)難題，尤其是針對早期胚胎這類難以操作的細胞。

電穿孔法作為一種物理方法，通過施加短暫的電脈沖，使細胞膜上形成瞬時微孔，從而提高細胞膜的通透性，使外源物質(zhì)如核酸分子能夠進入細胞內(nèi)。電穿孔法具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細胞、活體組織以及附植后胚胎的基因?qū)�入。然而，將電穿孔法�?yīng)用于附植前胚胎，尤其是由透明帶包裹的小鼠胚胎，具有特殊的難度。

本研究旨在建立并優(yōu)化一種電穿孔介導(dǎo)siRNA高效轉(zhuǎn)染小鼠附植前胚胎的方法，為采用siRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究基因在小鼠附植前胚胎中的功能提供技術(shù)參考。通過控制透明帶弱化程度、電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)等條件，結(jié)合使用不同介質(zhì)作為電轉(zhuǎn)緩沖液，實現(xiàn)siRNA的高效轉(zhuǎn)染。

材料與方法：

1. 試劑及儀器：
   • 試劑：Cy3標(biāo)記的陰性對照siRNA、臺氏液、某試劑opti-MEM、KSOM培養(yǎng)液、PBS緩沖液。
   • 儀器：威尼德電穿孔儀、熒光倒置顯微鏡、顯微操作器械。
2. 實驗方法：
   • 胚胎準備：選取發(fā)育健康的小鼠受精卵，使用臺氏液對胚胎透明帶進行弱化處理，消化時間為10秒。
   • 電穿孔參數(shù)設(shè)置：將處理后的胚胎置于電穿孔儀中，電轉(zhuǎn)緩沖液分別使用opti-MEM、KSOM和PBS。電穿孔參數(shù)設(shè)置為電壓30V，脈沖時間1毫秒，脈沖次數(shù)3次。
   • 轉(zhuǎn)染與觀察：將Cy3標(biāo)記的陰性對照siRNA導(dǎo)入胚胎，使用熒光倒置顯微鏡觀察胚胎的存活率、siRNA轉(zhuǎn)染率以及陽性轉(zhuǎn)染存活胚胎的囊胚發(fā)育率。

實驗結(jié)果：

1. 不同電轉(zhuǎn)緩沖液對電穿孔效率的影響：
   • 使用opti-MEM作為電轉(zhuǎn)緩沖液時，Cy3陽性轉(zhuǎn)染率最高，達到92%；使用KSOM實驗組轉(zhuǎn)染率最低，三組間差異顯著（P<0.05）；使用PBS作為電轉(zhuǎn)緩沖液時的陽性轉(zhuǎn)染存活胚胎的囊胚發(fā)育率顯著低于其他兩組。
2. 脈沖時間對電穿孔效率的影響：
   • 脈沖時間從600微秒延長至1毫秒時，陽性轉(zhuǎn)染率逐漸增加。繼續(xù)延長脈沖時間，轉(zhuǎn)染率提高不顯著，但胚胎存活率開始顯著下降。
3. 脈沖次數(shù)對電穿孔效率的影響：
   • 大多數(shù)細胞在脈沖次數(shù)為2-4次的條件下可以取得較為理想的轉(zhuǎn)染效果。綜合考慮轉(zhuǎn)染效率、胚胎存活率和囊胚發(fā)育率，3次脈沖可以獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。
4. 電穿孔轉(zhuǎn)染其他時期胚胎：
   • 使用優(yōu)化的電穿孔參數(shù)轉(zhuǎn)染小鼠其他時期胚胎，包括2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚，均取得良好效果，胚胎發(fā)育形態(tài)也未觀察到任何異常。

討論：

1. 透明帶弱化與電穿孔效率：
   • 透明帶對于胚胎在體內(nèi)的正常發(fā)育非常重要，但將透明帶完整的胚胎直接用于電穿孔時轉(zhuǎn)染效率很低。本研究采用對透明帶進行適度弱化的方法，同時提高電穿孔時的電壓，優(yōu)化脈沖時間和脈沖次數(shù)，顯著提高了轉(zhuǎn)染效率。
2. 電穿孔參數(shù)優(yōu)化：
   • 電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)是影響電穿孔效率的關(guān)鍵因素。本研究通過大量實驗，確定了最佳電穿孔參數(shù)：電壓30V，脈沖時間1毫秒，脈沖次數(shù)3次。在此條件下，siRNA的轉(zhuǎn)染效率最高，同時胚胎存活率和囊胚發(fā)育率也保持在較高水平。
3. 電轉(zhuǎn)緩沖液的選擇：
   • 電轉(zhuǎn)緩沖液的成分對電穿孔效率有顯著影響。本研究測試了幾種候選的電轉(zhuǎn)緩沖液，發(fā)現(xiàn)使用opti-MEM作為電轉(zhuǎn)緩沖液時，未觀察到明顯沉淀物生成，且電轉(zhuǎn)后胚胎發(fā)育形態(tài)良好。因此，opti-MEM是最佳的電轉(zhuǎn)緩沖液選擇。
4. 實驗策略與創(chuàng)新：
   • 本研究通過建立并優(yōu)化電穿孔介導(dǎo)siRNA高效轉(zhuǎn)染小鼠附植前胚胎的方法，為采用siRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究基因在小鼠附植前胚胎中的功能提供了有力的技術(shù)參考。該方法的創(chuàng)新之處在于：
     • 通過對透明帶進行適度弱化，提高了siRNA的穿透能力；
     • 優(yōu)化了電穿孔參數(shù)，實現(xiàn)了siRNA的高效轉(zhuǎn)染；
     • 選擇了合適的電轉(zhuǎn)緩沖液，保證了胚胎的正常發(fā)育。
5. 應(yīng)用前景：
   • 本研究建立的方法不僅可以用于小鼠附植前胚胎的基因功能研究，還可以擴展到其他物種和發(fā)育階段的胚胎研究。此外，該方法還可以用于基因治療、疾病模型構(gòu)建等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。

結(jié)論：

本研究成功建立了電穿孔介導(dǎo)siRNA高效轉(zhuǎn)染小鼠附植前胚胎的方法。通過優(yōu)化透明帶弱化程度、電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)等條件，結(jié)合使用合適的電轉(zhuǎn)緩沖液，實現(xiàn)了siRNA的簡便、高效轉(zhuǎn)染。該方法為基因功能研究提供了有力的技術(shù)參考，具有廣泛的應(yīng)用前景。未來，我們將進一步優(yōu)化實驗條件，提高轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率，為基因治療、疾病模型構(gòu)建等領(lǐng)域的研究提供更多技術(shù)支持。