顯微成像應用：癌癥免疫學中的3D超多標成像（上）
在癌癥免疫學研究中，評估組織變化和細胞相互作用對于識別特定細胞類型、評估免疫細胞活化狀態、監測特定蛋白質和/或基因標記物的表達以及表征腫瘤微環境至關重要。不同樣本之間的參數變化（例如健康與病變、治療與未治療）通常非常復雜，并且發生在三維環境中。
腫瘤細胞與其微環境的相互作用在很大程度上決定了某種類型癌癥的特征，因此成像策略是研究腫瘤組織的自然選擇。現代成像技術與多種組學方法的結合在空間生物學這一新興領域中發揮了關鍵作用。來自基因組學、 蛋白質組學和代謝組學的信息，與結構和空間-功能關系結合，可以提供其他方法難以獲得的洞見。
上述過程由分子和細胞之間復雜的相互作用驅動。因此，使用熒光成像研究這些過程的實驗設計需要能夠區分和定位大量標記物，由抗體識別并與合適染料結合的靶抗原。
常見的成像一組標記物的方法（即“面板”）包括每次最多4個標記的依次染色/成像/去染步驟，隨后對圖像進行校準并重新定位樣品。
理論上，通過不斷迭代，可以成像無限數量的標記物，然而在實際操作中，隨著多標記數量的提高，這變得更加困難。此外，只有在實驗結束后，即最后一次染色/成像/去染以及多圖像疊加完成后，才能看到所有標記的結果。
這一點尤為關鍵，因為在任何給定時刻只有少量標記物可見。成像策略無法改變，如果出現意外或新的情況，也無法返回感興趣區域進行進一步探索或更改成像參數，因為樣品已經不再相同。
多圖像疊加增加了實驗的復雜性，因為每輪成像都需要一個共同特征或標記，作為基準，使所有標記能夠虛擬地組合在一起。一個廣泛使用的策略是在每次迭代中用 DAPI染色作為錨點，犧牲一個成像通道來進行核染色。另一個限制在于染色/去染步驟的化學性操作，存在改變抗原和/或樣品物理完整性的風險，從而降低多標記結果的質量。最后，3D信息的重建并非經典流程中的操作，由于樣品重定位和循環染色導致的變形，使得這一步變得極其困難。
單次成像方法提供了強大的優勢，可以克服超多標應用的一些挑戰。
由于所有多標信息同時獲取，研究人員可以探索和調整成像策略，保護樣品免受嚴苛的去染處理，并直接在3D中獲得數據的結果，帶來額外維度的信息豐富性。
在此，我們通過對小鼠腫瘤組織進行的單次3D 15標（即15種標記物）實驗展示了這種方法的潛力（圖1a）。
選擇15種標記物使得科研工作者能夠對該組織中的一組免疫細胞、癌癥特征和結構標志物進行功能描述。
樣品準備過程中，將小鼠胰腺導管腺癌細胞（KPC-4662）皮下注射到C57Bl/6小鼠體內，并允許其生長3周。然后取出腫瘤，固定并制備厚度為70微米的切片并進行染色。
我們選擇了一組目標，以探討免疫腫瘤微環境：
- T細胞（CD4, CD8）
- B細胞（B220）
- 髓系細胞（包括樹突細胞）
- T細胞的功能標記（TCF1, FoxP3, PD1）
此外，實驗還包括了結構性和與癌癥相關的標記物：
- 增殖標記（Ki67）
- 基質細胞（α-SMA, MHC I）
- 上皮細胞（E-鈣黏蛋白, MHC I）
- 細胞外基質（Tenascin C）
- 內皮細胞（CD31）（圖1b）
使用STELLARIS共聚焦顯微鏡進行成像，該顯微鏡配備了名為SpectraPlex的新功能，專門為超多標成像方法提供一組工具。共聚焦功能不僅可以獲取薄組織切片的大視野圖像（如寬場的迭代成像方法），還可以在整個z范圍內生成3D 圖像。高分辨率的3D數據支持空間分布模式的全面探索。
利用SpectraPlex，該15標實驗的步驟由“標記面板”引導。這些標記物通過在軟件中定義生物目標和染料的組合來實現，并可添加到一個名為“虛擬冰箱”的數據庫中。數據庫中存儲了實驗室中常用或自創建的標記物。
將相關的標記物從虛擬冰箱中移動到專用工具中，即可創建面板通過實時計算，面板為顯微鏡采集設置提供建議。這為儀器的后續交互操作提供實驗控制的指導，而手動優化選項則為經驗豐富的用戶提供了靈活性。
在此示例中，基于先前經驗和商業染料設計確定了特定的目標-染料組合。我們利用了整個激發光譜范圍 （405nm及440–790nm）和熒光發射光譜（高達850nm）（圖1b）。
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