MAXI-IMAGING-PAM應(yīng)用于揭示番茄耐寒新機制

MAXI-IMAGING-PAM助力浙大喻景權(quán)院士團隊揭示番茄耐寒新機制
基因功能的分化主要由突變、基因復(fù)制和基因丟失驅(qū)動，對進化過程至關(guān)重要，其中順式調(diào)控區(qū)域的突變在轉(zhuǎn)錄調(diào)控的進化創(chuàng)新中起重要作用，但人們對其在作物進化過程中的變化和作用及其調(diào)控機制仍知之甚少。染色質(zhì)重塑在控制轉(zhuǎn)錄機制對DNA的可及性方面起關(guān)鍵作用，環(huán)境應(yīng)激可改變?nèi)旧�質(zhì)結(jié)構(gòu)從而影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)染色質(zhì)動力學(xué)的機制和程度在很大程度上仍是未知的，且染色質(zhì)動力學(xué)與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之間的因果關(guān)系需要進一步闡明。SWIB/MDM2結(jié)構(gòu)域蛋白在染色質(zhì)重塑和基因表達調(diào)控中起關(guān)鍵作用，但這些蛋白在植物中尤其是在細(xì)胞核中直接結(jié)合DNA的能力仍未被探索。不同種的番茄具有不同程度的耐寒性，野生多毛番茄（Solanum habrochaites）被認(rèn)為是最耐寒的番茄之一。由于生長環(huán)境的改變，在自然進化和人類選擇過程中，栽培番茄（Solanum lycopersicum）的耐寒性降低。冬春低溫對喜溫栽培番茄等設(shè)施農(nóng)業(yè)作物構(gòu)成重大威脅，導(dǎo)致其生長減緩、發(fā)育受損和產(chǎn)量降低。解析番茄耐寒能力下降的機制，培育耐寒種質(zhì)和優(yōu)化栽培管理措施，對于設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。
 

2024年8月6日，Nature Communications在線發(fā)表了浙江大學(xué)喻景權(quán)院士團隊周杰教授為通訊作者題為Loss of cold tolerance is conferred by absence of the WRKY34 promoter fragment during tomato evolution的研究論文。研究團隊對冷敏感的栽培番茄和耐寒的野生多毛番茄進行ATAC-Seq和RNA-Seq分析，發(fā)現(xiàn)WRKY34基因與冷脅迫下的染色質(zhì)可及性和表達模式密切相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，WRKY34啟動子中的60bp InDel導(dǎo)致了不同番茄品種在轉(zhuǎn)錄和耐寒性上的差異，該片段中的GATA順式調(diào)控元件與SWIBs和GATA29結(jié)合，協(xié)同抑制WRKY34的表達。此外，WRKY34還通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平干擾CBF冷響應(yīng)途徑。這些發(fā)現(xiàn)表明，順式調(diào)控區(qū)域的多態(tài)性對作物進化過程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達具有重要影響，進而影響了番茄的耐寒性。

主要研究結(jié)果
WRKY34在番茄響應(yīng)冷脅迫中具有潛在作用：通過對栽培番茄（Ailsa Craig，AC）和野生多毛番茄LA1777進行ATAC-Seq和RNA-Seq分析，發(fā)現(xiàn)WRKY34在冷脅迫下的表達和染色質(zhì)可及性在栽培番茄和野生多毛番茄中存在顯著差異，推測其可能在調(diào)節(jié)番茄耐寒性中發(fā)揮潛在作用。
 

圖1 冷脅迫后栽培番茄和野生番茄中ATAC-Seq和RNA-Seq的聯(lián)合分析結(jié)果，以及WRKY34的表達模式和蛋白質(zhì)積累差異。

WRKY34負(fù)向調(diào)節(jié)番茄的耐寒性：在LA4024、LA3942和LA1777中沉默SlWRKY34和ShWRKY34后，含有ShWRKY34基因的LA3942和LA1777的非沉默（TRV）幼苗比含有SlWRKY34基因的LA4024的TRV幼苗更耐寒，沉默ShWRKY34后仍保持較強的耐寒性，沉默SlWRKY34后LA4024的耐寒性顯著增強；過表達SlWRKY34和ShWRKY34會降低幼苗的耐寒性，敲除WRKY34會提高耐寒性，且WRKY34會抑制冷響應(yīng)基因CBFs和CORs的表達。

圖2 栽培番茄和野生番茄中WRKY34等位基因響應(yīng)冷脅迫的功能鑒定。

WRKY34啟動子區(qū)域的60bp InDel導(dǎo)致其在冷脅迫下的表達模式不同：通過比較不同番茄種質(zhì)中WRKY34的蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)其在冷脅迫下的表達模式差異而非蛋白質(zhì)功能差異決定了野生番茄和栽培番茄耐寒性的差異；對SlWRKY34和ShWRKY34的啟動子進行擴增和測序，發(fā)現(xiàn)野生番茄中存在60bp的插入，而栽培番茄中不存在，且該插入與WRKY34在冷脅迫下的表達抑制顯著相關(guān)。

圖3 WRKY34啟動子中的60bp插入/缺失（InDel）導(dǎo)致WRKY34在冷應(yīng)激下的不同表達模式。

SWIBs和GATA29直接結(jié)合到WRKY34啟動子的60bp InDel片段：通過酵母單雜交（Y1H）篩選，發(fā)現(xiàn)GATA家族轉(zhuǎn)錄因子SlGATA29和兩個SWIB/MDM2結(jié)構(gòu)域蛋白SlSWIBa和SlSWIBb能夠結(jié)合60bp InDel區(qū)域；SlGATA29和SlSWIBa/b通過與該區(qū)域結(jié)合抑制WRKY34的表達，且SlSWIBs和GATA29能夠協(xié)同抑制WRKY34的表達。

圖4 SlGATA29 和SlSWIBa/b 在冷脅迫下直接與 WRKY34 啟動子的60 個堿基對的插入/缺失（InDel）結(jié)合并抑制 WRKY34 表達。

圖5 SlSWIBa/b 和SlGATA29 協(xié)同抑制 WRKY34 表達

SWIB和GATA29通過60bp InDel影響染色質(zhì)可及性和耐寒性：在LA4024或LA3942背景下構(gòu)建SlSWIBb過表達株系和slswibab雙突變體，發(fā)現(xiàn)SWIBs能夠增強WRKY34啟動子的染色質(zhì)開放，從而提高番茄的耐寒性；構(gòu)建SlGATA29過表達株系和slgata29突變體，發(fā)現(xiàn)GATA29也能夠抑制WRKY34的表達，從而影響番茄的耐寒性；通過CRISPR/Cas9刪除LA3942中ShWRKY34啟動子的60bp，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的染色質(zhì)可及性減弱，WRKY34的表達抑制被消除，且植物對冷脅迫更敏感。

圖6 SlSWIBa/b增強了WRKY34啟動子的染色質(zhì)開放以提高番茄的耐寒性，這取決于 60 個堿基對的插入/缺失（InDel）。

WRKY34在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上破壞CBF-COR冷響應(yīng)途徑：SlWRKY34能夠與SlCBF1相互作用，干擾其轉(zhuǎn)錄功能，從而降低番茄幼苗的耐寒性；WRKY34還能夠直接結(jié)合CBFs和CORs的啟動子，抑制它們的表達。

圖7 SlWRKY34 干擾了SlCBF1 的轉(zhuǎn)錄活性，從而降低了番茄幼苗的耐寒性。

圖8 WRKY34 介導(dǎo)的番茄耐寒性模型

本研究揭示了番茄耐寒性的分子機制，為作物改良提供了理論依據(jù)，拓展了對基因調(diào)控的認(rèn)識，強調(diào)了基因編輯技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用潛力，對指導(dǎo)作物改良和育種具有重要意義。

參考文獻
Guo, M., Yang, F., Zhu, L., et al. Loss of cold tolerance is conferred by absence of the WRKY34 promoter fragment during tomato evolution[J]. Nature Communications, 2024, 15, 6667.

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