哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的主要構(gòu)成部分

       哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白的廣泛使用的平臺。哺乳動物細(xì)胞為蛋白表達(dá)提供了幾個優(yōu)勢，包括進(jìn)行復(fù)雜翻譯后修飾的能力、蛋白質(zhì)的正確折疊、將蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外環(huán)境中的能力等。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)廣泛用于生物技術(shù)和制藥工業(yè)，用于生產(chǎn)重組蛋白、疫苗、病毒載體和單克隆抗體。
 
      哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體是專門設(shè)計基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的DNA構(gòu)建體，載體含有靶基因有效轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)所需的幾個關(guān)鍵成分。接下來詳細(xì)介紹哺乳細(xì)胞蛋白表達(dá)載體元件構(gòu)成，以下是哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的主要成分：
 
1.啟動子：
 
       啟動子是一種DNA序列，它位于基因的上游，起著調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的作用，并決定基因表達(dá)的水平和特異性。通過募集RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子，啟動子能夠啟動轉(zhuǎn)錄過程。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中，常用的強(qiáng)組成型啟動子包括巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子、人延伸因子1α（EF1α）啟動子、猿猴空泡病毒40（SV40）啟動子、延伸因子1α（EF1α）啟動子以及人/鼠β肌動蛋白啟動子。這些啟動子能夠確保插入的基因在哺乳動物細(xì)胞中得到穩(wěn)定的表達(dá)。
 
2.增強(qiáng)子元件：
 
        增強(qiáng)子元件是一種DNA序列，其功能在于提升啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而增強(qiáng)基因的表達(dá)。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建中，常常引入源自病毒或細(xì)胞的增強(qiáng)子元件，如SV40增強(qiáng)子或人類即時早期巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子。這些元件的引入，旨在提高目的基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)水平。增強(qiáng)子可以位于啟動子區(qū)域的上游或下游，并發(fā)揮促進(jìn)靶基因高效表達(dá)的作用。
 
3.聚腺苷酸化信號（PolyA信號）：
 
       多腺苷酸化信號，也稱為polyA信號或polyA尾，是在轉(zhuǎn)錄過程中添加到信使核糖核酸3'端的腺嘌呤核苷酸序列，發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止和多聚（C）尾添加到mRNA轉(zhuǎn)錄物中的信號，在信使核糖核酸的穩(wěn)定性、從細(xì)胞核輸出和翻譯效率方面起著關(guān)鍵作用，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體通常包含基因下游的polyA信號，以確保適當(dāng)?shù)膍RNA處理和穩(wěn)定性。
 
4.選擇標(biāo)記：
 
        選擇標(biāo)記物是指能夠編碼出對特定抗生素或其他選擇性藥物產(chǎn)生耐藥性的蛋白質(zhì)的基因。這些標(biāo)記物通常用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗，以便鑒定和分離那些已經(jīng)將表達(dá)載體整合到其基因組中的哺乳動物細(xì)胞系。具體實例包括抗生素抗性基因，例如新霉素（neomycin）抗性基因或嘌呤霉素（puromycin）抗性基因，以及能夠賦予細(xì)胞對藥物抗性的基因，例如潮霉素抗性基因或殺稻瘟菌素（blasticidin）抗性基因。這些選擇標(biāo)記物的應(yīng)用，有助于在細(xì)胞培養(yǎng)和基因工程中實現(xiàn)高效、準(zhǔn)確的細(xì)胞篩選和鑒定。
 
5.復(fù)制的起始點（ORI）：
 
        復(fù)制的起始點是作為DNA復(fù)制起點的DNA序列。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中，可包含源自哺乳動物病毒（如SV40或牛乳頭瘤病毒（BPV）來源）的ORI，以確保載體DNA在哺乳動物細(xì)胞中的有效復(fù)制。然而，對于質(zhì)粒等非病毒載體，細(xì)菌ORI（例如ColE1來源）也可能存在于細(xì)菌宿主中用于繁殖。
 
6.細(xì)菌的選擇性標(biāo)記：
 
        哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體通常在細(xì)菌宿主如大腸桿菌中繁殖和擴(kuò)增。因此，它們通常包含細(xì)菌生長的選擇性標(biāo)記，例如抗生素抗性基因（例如，氨芐青霉素或卡那霉素抗性基因），能夠在細(xì)菌培養(yǎng)中的克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增步驟中選擇攜帶表達(dá)載體的菌落。
 
7.多克隆位點（MCS）：
 
       多克隆位點（MCS），乃一種簡短的DNA序列，內(nèi)含多個獨特的限制性內(nèi)切酶識別位點。MCS通常坐落于啟動子下游以及其他表達(dá)元件上游，這些位點通過限制性內(nèi)切酶的消化與連接作用，為將特定基因方便地插入載體中提供了可能。通過提供多種限制性位點以定向克隆DNA片段，MCS大大簡化了克隆過程。
  
      此外，根據(jù)實驗或應(yīng)用的具體要求，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體可以包含其他元件，例如用于蛋白質(zhì)分泌的信號肽、用于蛋白質(zhì)檢測和蛋白純化的表位標(biāo)簽或用于誘導(dǎo)表達(dá)的特定調(diào)節(jié)元件。
 
     通過表達(dá)載體基本成分，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體能夠在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)基因，用于各種研究、生物技術(shù)和治療應(yīng)用，載體可以根據(jù)特定的實驗要求進(jìn)行定制和優(yōu)化，包括啟動子、選擇標(biāo)記和其他調(diào)控元件的選擇。