半骨透明化技術揭示骨髓移植后神經促進造血干細胞和血管再生的機制

北京生命科學研究所（NIBS）/清華大學生物醫學交叉研究院沈博實驗室發現外周神經和LepR⁺細胞（LepR陽性間充質細胞）通過相互作用促進骨髓移植后造血和血管系統的再生。

造血干細胞是我們身體中幾乎所有血細胞的來源，它們存在于骨髓中獨特的微環境里。骨髓中分布著豐富的外周神經。造血干細胞領域內之前的研究通過手術橫斷、化學藥物消融等方法消融神經，探索了骨髓內外周神經對于造血干細胞的維持、遷移和再生等生命活動的潛在作用，但是由于不同的骨髓內外周神經消融手段導致的實驗結果并不完全一致，所以目前對于骨髓內外周神經對造血干細胞的功能仍舊存在爭議。

2023年11月27日，北京生命科學研究所（NIBS）/清華大學生物醫學交叉研究院沈博實驗室，與美國西南醫學中心/霍華德休斯研究所Sean Morrison院士實驗室合作，在Nature Cell Biology雜志發表了文章 “Leptin receptor⁺ cells promote bone marrow innervation and regeneration by synthesizing nerve growth factor”。該研究使用半骨透明化技術進行深度成像，揭示了骨髓內外周神經通過促進LepR⁺細胞釋放生長因子來促進骨髓再生。沈博實驗室PTN項目，北京大學前沿交叉學科研究院博士生高祥為本論文的第一作者。沈博研究員和Sean Morrison院士為本論文的共同通訊作者。本論文的其他作者還包括沈博實驗室的倪悅涵（北京師范大學生命科學學院）、楊敏（北京師范大學生命科學學院）、張祎旋、郭嘉茗（PTN項目，北京大學前沿交叉學科研究院），以及中國藥科大學的方慎彤教授。本研究得到了國家自然科學基金委、北京生命科學研究所的資助。

在本研究中，沈博實驗室使用了一種半骨透明化成像技術，可以保留骨組織完整的三維結構對半骨進行深度成像。該實驗方法可以對半骨或其他多種組織進行多組合的抗體熒光標記。制備完成后的半骨可以使用Leica Stellairis 8 DIVE成像并通過相關軟件對獲得的圖像進行定性或定量的分析。

在這項工作中，作者首先通過分析測序數據發現骨髓內主要僅表達單一的一種神經生長因子Nerve Growth Factor（NGF），而且主要由 LepR 陽性間充質細胞（LepR⁺細胞）表達。作者構建了Ngf^mScarlet/+報告小鼠，使用半骨透明化技術進行深度成像，證明了這一發現（圖1）：Ngf-mScarlet⁺細胞主要分布在Endomucin^high的血竇和Endomucin^low的小動脈周圍。骨髓中存在密度更高的血竇，意味著Ngf-mScarlet⁺細胞主要分布在血竇周圍，這些血竇周圍的細胞是LepR⁺細胞。測序數據表明，圖中小動脈周圍的Ngf-mScarlet⁺細胞主要是LepR⁺Osteolectin⁺細胞和平滑肌細胞。

圖1.成年Ngf^mScarlet/+小鼠股骨骨髓的深度成像。Ngf-mScarlet⁺細胞主要分布在Endomucin^high的血竇（箭頭）和Endomucin^low的小動脈周圍（長箭頭）。
 

接下來，沈博實驗室構建了骨髓內外周神經特異性消融的小鼠模型（去神經小鼠）：他們使用半骨透明化技術發現六月齡的Lepr^cre；Ngf^fl/-小鼠骨髓中外周神經纖維完全消失而髓外外周神經并沒有受到影響（圖2）。這些結果表明，LepR⁺細胞合成的NGF對骨髓內神經的維持十分重要。進一步的實驗顯示，去神經小鼠的造血干祖細胞及血液系統在穩態維持情況下功能完全正常，說明骨髓內造血干祖細胞的維持不依賴于髓內外周神經。

圖2. 6-8月齡Lepr^cre; Ngf^fl/-小鼠和Ngf^fl/-同窩對照小鼠股骨骨髓的深度成像

進一步的研究表明，骨髓內LepR⁺細胞及分化的脂肪細胞在骨髓移植前的輻射清髓后增加了NGF的釋放，導致骨髓內外周神經纖維增多并通過刺激LepR⁺細胞釋放更多的生長因子（比如SCF，VEGF，和Ang2）促進造血和血管系統的再生。機制上，外周神經通過釋放神經遞質激活LepR⁺細胞中的b2和b3腎上腺素能受體通路，刺激該細胞釋放多種生長因子以促進造血和血管系統的再生。在LepR⁺細胞中條件性敲除編碼b2和b3腎上腺素能受體的基因Adrb2和Adrb3抑制了LepR⁺釋放SCF等生長因子，并阻礙了造血和血管系統的恢復。

綜上所述，外周神經和LepR⁺細胞通過相互作用促進骨髓移植后造血和血管系統的再生，其中LepR⁺細胞通過合成NGF促進骨髓神經的維持及其清髓后的生長，而骨髓神經通過刺激LepR⁺細胞釋放多種生長因子來促進骨髓再生（見圖3）。本研究為造血干細胞移植以及白血病等血液疾病的臨床治療提供了重要參考。
 

圖3.骨髓內外周神經和LepR⁺細胞通過相互作用促進骨髓造血和血管系統的再生

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