目的基因插入酵母菌株實(shí)驗(yàn)步驟

一、感受態(tài)制備
1）接種酵母受體菌單菌落于YPD 平板，30℃培養(yǎng)2 天；
2）挑取平板上的單菌落接種于10 ml YPD 液體培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩過夜；
3）過夜培養(yǎng)后按1%左右的接種量接種到100 ml YPD 培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至 OD 值1.2~1.5；
4）4℃，5000 rpm 離心5 min 收集沉淀菌體，用100 ml 預(yù)冷無菌水重懸菌體；
5）4℃，5000 rpm 離心10 min 收集沉淀菌體，用 100 ml 預(yù)冷無菌水重懸菌體；
6）再次4℃，5000 rpm 離心 10 min 收集沉淀菌體，用 100 ml 預(yù)冷無菌水重懸菌體；
7）20 ml，1 mol/L 山梨醇洗滌1 次；
8）將菌體溶于200 ul，1 mol/L 預(yù)冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置幾小時(shí)，待轉(zhuǎn)化

二、電轉(zhuǎn)涂板
1）準(zhǔn)備好80 ul 的酵母感受態(tài)與線性化的質(zhì)粒 1-5 ug（冰上預(yù)冷15 min）混合，迅速放入0.2 cm 的電擊杯中（電擊杯冰上預(yù)冷滅菌），電擊；
2）電擊結(jié)束，迅速加入1 ml 山梨醇，涂平板（在搖床上培養(yǎng)1 h 后涂平板也可）；
3）MD 培養(yǎng)基生長(zhǎng)3-4 天，ROB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4-5 天后，鑒定。
電擊注意事項(xiàng)：
1）線性化質(zhì)粒的含量在1-5 ug，純度越高越好，量要有保證，很多人找不到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以考慮是否是這個(gè)因素造成；
2）感受態(tài)菌液收集，確定OD 值在 1.2-1.5 之間，可以稀釋不同倍數(shù)，判斷是否是線性關(guān)系，菌液渾濁單OD 值不高，可能是OD 稀釋倍數(shù)不夠；
3）感受態(tài)保存，感受態(tài)制備但其他還沒處理好，冰上放置的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率也會(huì)有影響，因此還是那個(gè)原則：現(xiàn)做現(xiàn)用；且分裝成每次夠用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染；
4）電擊杯清洗，先洗凈吹干，浸泡在75%乙醇中，使用前超凈臺(tái)紫外滅菌，重復(fù)使用對(duì)實(shí)驗(yàn)也會(huì)有一定影響；
5）電擊參數(shù)，電壓及電擊時(shí)間可以摸索，適當(dāng)增加電壓或延長(zhǎng)電擊時(shí)間，電擊過程冰上操作

三、挑單克隆
Mut+ 和Muts 表型的判斷
待轉(zhuǎn)化子在平板上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，進(jìn)行Mut+ 和Muts 的篩選。挑取單克隆，在MM 及MD 培養(yǎng)基上劃線或點(diǎn)（先在MM 平板上點(diǎn)，再在MD 平板上點(diǎn)，一個(gè)克隆換一次牙簽），30℃培養(yǎng)2 天。觀察，在MD 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在MM 培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或長(zhǎng)的很小即為Muts 表型，其余為Mut+ 表型。

四、PCR鑒定重組子的方法
模板的處理
1.平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見時(shí)（約12 小時(shí)）；
2.將除了模板之外的其它PCR 反應(yīng)液的組分準(zhǔn)備好，并分裝。引物最好使用Kit 中己有的檢測(cè)專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可以鑒定非定向克隆的方向）；
3.用滅菌的牙簽挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一個(gè)滅菌的1.5 毫升離心管，對(duì)PCR 管和1.5 毫升離心管編號(hào)；
4.PCR擴(kuò)增，1% agarose 電泳。
畢酵母基因組提取方法
1.接種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5 ml YPDZ培養(yǎng)基，GS115 菌于YPD 培養(yǎng)基作對(duì)照，30℃，培養(yǎng)16~18 小時(shí)。
2.室溫下，1500 g離心5-10 min 收集茵體。
3.100 ul TE (pH 7.0)重懸，加入 300 ul EDTA (pH 8.0) 0.07M Tris -HC,3 u蔬基乙醇，l ul Lyticase ，37℃水浴30 min。
4.10000 g離心5~10 min，取沉淀，加90 ul TE 重懸。
5.200 ul 飽和酚，200 ul氯仿，混勻，離心30 s ，取上層水相。
6.加入兩倍體積無水乙醇以及1/10 體積的NaAC，-20℃放置30 min;
7.10000 g離心20 min，棄上清;75%乙醇漂洗沉淀一次，
8.干燥后，加入15 ul的TE或H₂0溶解，-20℃?zhèn)溆谩?br />