抗體FC驗證應用實驗細胞染色步驟詳解
一、細胞表面染色操作流程
①細胞計數
細胞計數：將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數；500g離心4min，去上清。
②制備單細胞懸液
將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細胞懸液。
③（可選）阻斷Fc受體
室溫孵育10-20min。
④一抗孵育
每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應30min。
⑤洗滌
400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
⑥二抗孵育
對于非熒光染料直標抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟8。
⑦ 洗滌
400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
⑧重懸細胞
用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。
二、細胞胞內染色操作流程
①細胞計數
將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數；500g離心4min，去上清。
②制備單細胞懸液
將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細胞懸液，400g離心5min去上清。
③固定
每孔加入100μl細胞固定劑重懸細胞，2-8°孵育20min。
④洗滌
400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
⑤洗滌
每孔加入100μl細胞通透劑重懸細胞，室溫孵育20min。
⑥洗滌
400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
⑦ (可選）阻斷Fc受體：
10-20min。
⑧一抗孵育
每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應30min。
⑨洗滌
400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
⑩二抗孵育
對于非熒光染料直標抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟11。
⑪洗滌
400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。
⑫上機分析
用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。
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