使用NanoBiT技術進行的蛋白質相互作用細胞內定位成像實驗

蛋白質相互作用（PPI）是指兩種蛋白質之間直接物理接觸的反應過程。鑒于大多數細胞過程都涉及到多種蛋白質的共同作用，研究成對或更大群體的蛋白質相互作用在藥物開發和疾病研究等多個研究領域都發揮著重要作用。在體外環境下，有多種方法可以檢測蛋白質相互作用，但這些體外模型不能準確還原細胞內環境。此外，一些PPI在體檢測方法需要裂解細胞并使用專門的設備才能進行定量檢測。

為了克服這些挑戰，Promega開發了NanoLuc Binary Technology （NanoBiT）。NanoBiT是一種結構互補報告分子系統，可用于PPI的細胞內檢測。它已成功應用于藥物篩選、信號傳導分析和病毒感染機制分析等一系列研究領域。該系統由一個LargeBiT（LgBiT；17.6 kDa）和一個Small BiT（SmBiT；11個氨基酸）兩個亞基組成，可分別與待測蛋白融合。若兩個待測蛋白存在相互作用，LgBiT 會和 SmBiT 結構互補形成功能性熒光素酶，從而與底物反應產生明亮的發光信號（圖1）。

圖1. NanoBiT蛋白質相互作用系統概覽。圖像承蒙Promega提供。
 

NanoBiT的細胞內定位成像

為進行細胞質和細胞核表達，我們將兩種載體對轉染到HeLa細胞中。第一對為非靶向FKBP-SmBiT對照載體和FRB-LgBiT對照載體。第二對為細胞核靶向NLS¹-FKBP-SmBiT對照載體和FRB-LgBiT對照載體（圖2）。FKBP和FRB會在雷帕霉素刺激下結合產生發光信號。

圖2. FKBP/FRB NanoBiT和NLS-FKBP/RRB NanoBiT的細胞內定位。

隨后，我們使用IXplore Live for Luminescence顯微成像系統對表達NanoBiT的HeLa細胞進行生物發光成像²。
 

為了定位細胞核，我們使用Hoechst33342對HeLa細胞進行了復染，并在同一顯微鏡上進行熒光成像（圖3）。由于非靶向FKBP/FRB NanoBiT在整個細胞質中擴散，我們在整個HeLa細胞中都觀察到了生物發光信號。
 

而NLS-FKBP/FRB NanoBiT的生物發光信號通過與Hoechst33342熒光信號重疊，被證實位于細胞核。

圖 3. FKBP/FRB NanoBiT和NLS-FKBP/RRB NanoBiT的細胞內定位。
 

實驗條件：

• 顯微鏡：IXplore Live for Luminescence顯微鏡系統²（圖4）

• 相機：imagEM EM-CCD相機(Hamamatsu Photonics)

• 物鏡：LUCPLFLN60XPH（圖5）

• 成像透鏡：0.35X

• EM增益：1200

• 呋喃嗪濃度：1/200稀釋

• 雷帕霉素最終濃度：30 nM

• 曝光時間：相襯50 ms/生物發光3 min/熒光100 ms

   

圖4. IXplore Live for Luminescence顯微鏡系統
 

圖5. LUCPLFLN60XPH及UPLFLN40XPH物鏡
 

圖6顯示了雷帕霉素刺激前后的NLS-FKBP/FRB NanoBiT生物發光變化情況。雷帕霉素刺激后細胞核內的生物發光強度增加。這些結果表明，在雷帕霉素刺激下，FKBP和FRB在細胞核內結合，這種相互作用引起了NanoLuc的生物發光。顯微成像使我們能夠觀察到活細胞內細胞溶質和細胞核生物發光強度變化，從而檢測到雷帕霉素刺激引起的FKBP和FRB的相互作用。

 
實驗條件：

• 載體：NLS-FKBP-SmBiT/FRB-LgBit載體（各50 ng）

• 顯微鏡：IXplore Live for Luminescence顯微鏡系統²

• 相機：imagEM EM-CCD相機(Hamamatsu Photonics)

• EM增益：1200

• 物鏡：UPLFLN40XPH

• 成像透鏡：0.35X

• 曝光時間：相襯50 ms/生物發光30 s/熒光100 ms

• 延時間隔：40 s
   

使用光度計和生物發光顯微鏡進行PPI探測

NanoBiT和HiBiT3技術使我們能夠使用光度計實現高通量PPI檢測，而顯微成像技術使我們能夠將這些PPI的細胞內定位可視化。將光度計與生物發光顯微鏡聯用檢測PPI具有諸多優點。

在觀察局部發生的PPI或其細胞內定位變化時，我們可以先使用顯微成像來確認其定位的準確性，然后再使用光度計進行高通量測量。該系統無需額外熒光成像便可確認細胞內定位。我們可以使用表達NanoBiT或HiBiT的同一構建細胞系來檢查細胞內定位和高通量光度計探測。
 

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致謝

本應用說明的作者是Taro Hayashi，Evident生物工程、高級光學生物工程、研究與開發研究員。

1.細胞核定位信號（我們使用了3倍重復細胞核定位信號）。

2.基于IXplore Live顯微鏡的生物發光成像系統。該系統是根據日本大阪大學長井教授、Tokai Hit., Co, Ltd.及Evident聯合開發的成果設計的。這項工作是在日本科學技術振興機構開發先進測量和分析系統的計劃下完成的。

3.用于通過使用11個氨基酸肽標簽(HiBiT)和大約18 kDa NanoLuc熒光素酶片段(LgBiT)的生物發光探測靶蛋白的HiBiT技術。
 

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