雙光子鈣成像應用：海馬星形膠質細胞編碼獎賞位置研究
復旦大學腦科學轉化研究院
有這么一則小故事，主人為了讓驢一直跑，就用桿子挑著一根胡蘿卜，吊在驢的面前，驢為了吃到胡蘿卜就不停地向前走，走啊，走啊...
當然，這只是一個故事。有人拿一頭真正的毛驢做了實驗，吊著一根胡蘿卜領著毛驢走，毛驢確實向胡蘿卜所在的方向走了幾步，但是當發現吃不到胡蘿卜時就走開了。
這里面涉及了一個有趣的獎勵記憶的機制。過去胡蘿卜擺在前面，驢只要向前走就能吃到，于是當驢看到胡蘿卜時，就會向前走，當前進這一行為無法縮短與胡蘿卜的距離，與過去對獎勵的記憶相違背時，這種對獎勵的記憶就會消失。
【海馬體/獎勵記憶】
海馬體被認為在新記憶的形成中起著關鍵作用，獎勵記憶就包含其中。獎勵記憶的研究大多使用小鼠，一般讓小鼠渴幾天，隨后讓小鼠進行某種重復活動，在某一位置給小鼠水獎勵，進行獎勵位置的記憶訓練。
1971年J.O'Keefe和J.Dostrovsky發表在Brain Res上的研究表明，小鼠海馬體神經元的活動在靠近獎勵位置的區域時會有明顯上升[1]。2018年Jeffrey L Gauthier和David W Tank發表在Neuron上的研究表明，小鼠海馬體CA1區的神經元在獎勵位置附近活躍[2]。2022年Adi Doron等研究了小鼠海馬體CA1區的星形膠質細胞在獎勵記憶中的作用，研究成果發表在了Nature上[3]。
圖1：虛擬現實期間對小鼠CA1區星形膠質細胞進行雙光子鈣成像[3]
【活體雙光子鈣成像】
將病毒AAV5-gfaABC1D-cyto-GCaMP6f注射進小鼠海馬體CA1區中（使用病毒載體AAV5，以星形膠質細胞特異性gfaABC1D為啟動子，在CA1區的星形膠質細胞中特異性表達胞質靶向鈣指示劑cyto-GCaMP6f），由于海馬體距離小鼠大腦表面超過了雙光子成像的最大深度（最大深度1mm），于是選擇在錐體細胞層上方100 µm處放置成像窗口，用雙光子顯微鏡對CA1區星形膠質細胞進行長期鈣成像。
[視頻來源于：www.goshenlab.com/movies]
將雙光子鈣成像與定制的圓形虛擬現實（VR）設備相結合，訓練頭部固定的小鼠在跑步機皮帶（皮帶長度170 cm）上跑步，完成每圈 170 cm后給予一次水獎勵，與虛擬環境中的特定位置相匹配。訓練過的小鼠在4分鐘內可以完成15圈跑動。
為了增加每段時間成像的星形膠質細胞ROI（regions of interest）的數量，使用聚焦于CA1區不同深度的電動快速可調焦透鏡，在兩個不同的FOV（fields of view）中對CA1星形膠質細胞進行雙光子鈣成像。
視頻2：兩個CA1區視場中的星形膠質細胞鈣活動[3]
每個FOV中的成像結果以每秒7.745幀的速度采集，并在運動校正后顯示，單個星形膠質細胞ROI在每個FOV中半自動分割獲得。從而獲得兩個FOV中，單個星形膠質細胞在一段時間內的鈣活動變化，提取來自每個ROI的信號后，計算Δ F/F，得出圖1f。
圖2：海馬CA1區星形膠質細胞對獎勵位置有記憶[3]
【海馬星形膠質細胞編碼獎賞位置】
小鼠星形膠質細胞可以對獎勵位置形成記憶嗎？左圖不同的顏色代表小鼠在跑道上不同的位置，星號代表水獎勵交付。隨著小鼠向獎勵位置的靠近，CA1區星形膠質細胞活動事件增加。右圖每一條線代表一只小鼠，海馬CA1區星形膠質細胞的同步鈣活動隨著向獎勵位置靠近而升高，出現了明顯向獎勵位置的傾斜。這種傾斜說明海馬CA1區星形膠質細胞對獎勵位置產生了記憶。
圖3：獎勵位置不是實際的位置，而是獎勵的屬性[3]
獎勵位置是獎勵的屬性還是實際的位置呢？當獎勵在沿跑道的隨機位置給予時，小鼠海馬CA1區星形膠質細胞的同步鈣活動向獎勵位置的傾斜消失。當小鼠跑到第11圈時，在相同環境中的新位置給予獎勵，傾斜消失，重新訓練一段時間后，傾斜出現了恢復。兩個實驗均表明星形膠質細胞編碼的位置不是實際位置，而是獎勵的一種屬性。
圖4：對獎勵位置的記憶依賴于熟悉的環境[3]
小鼠星形膠質細胞靠什么記憶獎勵位置，是周圍的環境嗎？跑步機皮帶提供觸覺提示，虛擬現實顯示器提供視覺提示。小鼠在特定觸覺提示與視覺提示的組合中接受了一段時間的訓練，這一組合被稱為熟悉環境，改變觸覺提示與視覺提示，形成新環境。星形膠質細胞活動在熟悉的環境中表現出向獎勵位置的傾斜，但在新環境中卻沒有。在新環境中重新訓練一段時間后，傾斜出現恢復。說明小鼠對獎勵位置的記憶依賴于熟悉的環境。
圖5：星形膠質細胞可以靠觸覺記憶獎勵位置[3]
此處的熟悉環境包括視覺線索和觸覺線索，星形膠質細胞靠哪種感官記憶獎勵位置？在熟悉的環境中訓練小鼠，在成像過程中關閉虛擬現實顯示器，視覺線索消失，水獎勵在相同的位置給予。傾斜依舊存在，說明星形膠質細胞可以靠觸覺記憶獎勵位置。
圖6：在熟悉環境中可以通過星形膠質細胞鈣活動解碼小鼠位置[3]
能從星形膠質細胞鈣活動解碼小鼠位置嗎？在熟悉環境中，解碼的預期小鼠位置與小鼠的實際位置基本符合，在新環境中，解碼的預期小鼠位置與小鼠的實際位置相差較大，說明在熟悉環境中可以通過星形膠質細胞鈣活動解碼小鼠位置。綜上所述，小鼠海馬體CA1區的星形膠質細胞可以在熟悉的環境中通過觸覺記憶獎勵的預期位置，并且憑借星形膠質細胞的活動可以在熟悉的環境中重建小鼠的運動軌跡。
以此類推，想要讓小毛驢一直追著胡蘿卜走，至少要做到以下幾點：
1.保持毛驢對蘿卜的渴望。
2.長時間重復訓練，讓毛驢每走一定步數或距離就可以吃到胡蘿卜。
3.使毛驢處于熟悉的環境中。這么看來，讓毛驢在蘿卜的誘惑下背著人走的難度實在有些高，還是訓練毛驢在蘿卜的誘惑下拉磨更有可行性一些。
【號外、號外】
EVIDENT 進一步完善活體雙光子鈣成像方案，震撼推出搭配內調焦（電動快速可調焦透鏡）自由旋轉物鏡的龍門型雙光子顯微成像系統。
參考文獻：
[1]O'Keefe J, Dostrovsky J. The hippocampus as a spatial map: Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat[J]. Brain research, 1971,34(1):171-5.
[2]Gauthier J L, Tank D W. A dedicated population for reward coding in the hippocampus[J]. Neuron, 2018, 99(1): 179-193.
[3]Doron A, Rubin A, Benmelech-Chovav A, et al. Hippocampal astrocytes encode reward location[J]. Nature, 2022, 609(7928): 772-778.
