如何從共聚焦圖像中去除自發(fā)熒光

自發(fā)熒光

了解自發(fā)熒光的常見原因，以及如何從您的共聚焦顯微鏡成像過程中去除它。根據(jù)您的應(yīng)用，可能有任意數(shù)量的自發(fā)熒光來源，但幸運(yùn)的是，解決方案同樣也多種多樣——從改變您的介質(zhì)到使用熒光壽命成像和遠(yuǎn)紅區(qū)染料。

引言

熒光顯微鏡已經(jīng)徹底改變了我們對生物學(xué)的理解。通過以高空間分辨率定位細(xì)胞內(nèi)特定分子事件，人們對從基因表達(dá)途徑到藥物相互作用的各個(gè)方面有了深入的了解。
隨著現(xiàn)代共聚焦顯微鏡技術(shù)的改進(jìn)，其靈敏度也在提高。在共聚焦成像過程中，一個(gè)關(guān)鍵的因素是信噪比，背景噪音會(huì)掩蓋信號(hào)的微小變化。
在共聚焦顯微鏡中，噪音的最大來源之一是自發(fā)熒光。去除這種背景對于理解樣品中存在的信號(hào)的微小差異至關(guān)重要。在這篇綜述中，我們將探討如何通過一些快速修復(fù)方法和一些現(xiàn)代技術(shù)去除自發(fā)熒光，如熒光壽命成像。借助軟件和顯微鏡硬件方面的進(jìn)步，這些技術(shù)越來越容易使用。

自發(fā)熒光的原因

自發(fā)熒光有許多潛在的原因，在一個(gè)樣品中往往有多個(gè)來源。首先，細(xì)胞制劑本身可以是內(nèi)源性自發(fā)熒光的來源。一些常見的來源是NADH、黃素、脂褐素、膠原蛋白和彈性蛋白，以及植物樣品中的葉綠素和木質(zhì)素。換句話說，它們是很難消除的。
除了細(xì)胞增加了自發(fā)熒光外，在成像前處理樣品的方式也會(huì)引入額外的背景熒光。從處理試劑到封片介質(zhì)，這可能是任何東西。在去除自發(fā)熒光之前，找到自發(fā)熒光的來源是很重要的。

消除自發(fā)熒光的方法

了解您的樣品
如果您遇到自發(fā)熒光的問題，首先要做的是通過調(diào)查樣品來嘗試確定原因。當(dāng)您開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，先選擇一個(gè)未標(biāo)記的對照品，以確定染色過程中是否有增加背景熒光。
了解您的自發(fā)熒光的光譜也很重要。這可以通過光譜掃描來確定。光譜掃描將有助于實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和避免自發(fā)熒光的峰值。

優(yōu)化熒標(biāo)記
一旦您了解了自發(fā)熒光的光譜，下一個(gè)階段就是優(yōu)化熒光標(biāo)記選擇。如果自發(fā)熒光的光譜和您的熒光標(biāo)記的光譜高度重疊，那么您的信號(hào)很有可能會(huì)被自發(fā)熒光所掩蓋。在這種情況下，選擇一個(gè)光譜遠(yuǎn)離背景自發(fā)熒光的熒光標(biāo)記。例如，如果您的自發(fā)熒光是在光譜的藍(lán)色區(qū)域，將您的熒光標(biāo)記移到綠色或紅色區(qū)域。

選擇熒光團(tuán)時(shí)，選擇新型探針，如Alexa Fluor、Dylight或Atto。這些染料往往更亮，更穩(wěn)定，并且激發(fā)和發(fā)射帶更窄，可以更容易地選擇您的熒光標(biāo)記的信號(hào)。如果您的顯微鏡能檢測到它們，遠(yuǎn)紅區(qū)染料是避免自發(fā)熒光問題的有效方法，因?yàn)檫@些波長在生物樣品中很少出現(xiàn)。檢測到遠(yuǎn)紅染料還有一個(gè)好處，就是能夠擴(kuò)大用于多色實(shí)驗(yàn)的通道數(shù)量。

選擇熒光標(biāo)記后，重要的是不要盲目地用說明書上列出的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。更多的時(shí)候，需要對熒光團(tuán)進(jìn)行滴定，在您的樣品上測試不同的濃度。這可以讓您看到哪種濃度能更有效地與背景區(qū)分，并減少自發(fā)熒光產(chǎn)生的干擾。按照制造商的說明，創(chuàng)建一個(gè)熒光標(biāo)記的稀釋梯度，以涵蓋略低于和略高于推薦用量的范圍。用您的樣品測試這些稀釋液，以確定哪種稀釋液會(huì)給您帶來最有效的信號(hào)。

優(yōu)化您的顯微鏡設(shè)置
共聚焦顯微鏡的設(shè)置對圖像中的可見信號(hào)發(fā)揮著重要的作用，包括自發(fā)熒光。利用這些設(shè)置的優(yōu)勢，通過調(diào)整光譜檢測，盡可能多地切斷自發(fā)熒光信號(hào)。根據(jù)顯微鏡的不同，有不同的方法，但最靈活的選擇是選擇一個(gè)白激光與光譜檢測器相配合。這樣，您可以精確調(diào)整到達(dá)樣品的光的波長，以及通過檢測器的波長。通過這種方式，在選擇哪些信號(hào)被記錄在捕獲的圖像中時(shí)，可以進(jìn)行非常精細(xì)的控制，并有足夠的機(jī)會(huì)消除自發(fā)熒光。

圖1：當(dāng)比較自發(fā)熒光和熒光標(biāo)記的光譜時(shí)，挑選一個(gè)與自發(fā)熒光信號(hào)不重疊的熒光標(biāo)記。

處理您的樣品以避免自發(fā)熒光
通常自發(fā)熒光不是來自樣品，而是來自成像前的處理方式。例如，封片介質(zhì)、組織培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)室器皿都可能是自發(fā)熒光的來源。

如果您正在進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，那么考慮在成像前用預(yù)熱的不含酚紅的培養(yǎng)基或透明的緩沖鹽水代替正常的培養(yǎng)基。除了pH指示劑酚紅（在440納米處被激發(fā)時(shí)具有高強(qiáng)度熒光）外，培養(yǎng)基和試劑（如FBS）可能含有許多蛋白質(zhì)和小分子，它們本身具有熒光信號(hào)--如果不去除它們，所有這些都會(huì)造成強(qiáng)烈的自發(fā)熒光背景。如果您決定將您的細(xì)胞換成一種新的培養(yǎng)基進(jìn)行活體成像，重要的是要注意這可能會(huì)引起細(xì)胞行為和表型的意外變化，所以根據(jù)您的研究內(nèi)容，您可能需要先讓細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基。

您也可以測量一下您用同一顯微鏡設(shè)置的器皿的自發(fā)熒光，查看是否是自發(fā)熒光的來源。測量時(shí)，請嘗試使用帶玻璃底的培養(yǎng)皿或?qū)ｉT用于去除自發(fā)熒光信號(hào)的玻璃底皿進(jìn)行成像。
在對暴露于化學(xué)品的活檢和組織樣本進(jìn)行成像時(shí)也會(huì)出現(xiàn)類似的問題。一個(gè)常見的例子是消化道，如果它被暴露在抗生素（如四環(huán)素）中，會(huì)有大量的自發(fā)熒光，這些抗生素有強(qiáng)烈的熒光特征。在這種情況下，通過用緩沖鹽水che di沖洗或謹(jǐn)慎使用溶劑，可以很容易去除熒光。
如果您要固定細(xì)胞，固定方法會(huì)對自發(fā)熒光有很大影響。考慮用福爾馬林和戊二醛的替代品，并且在成像前盡量不要將固定的樣品存放太久，因?yàn)?strong>自發(fā)熒光會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加。

軟 件
雖然最理想的方式是通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除自發(fā)熒光，但有些時(shí)候這是無法實(shí)現(xiàn)的。在這些情況下，可以通過計(jì)算來解決您的自發(fā)熒光問題。使用您的顯微鏡軟件或開源解決方案，如ImageJ，可以分析含有自發(fā)熒光的像素，并嘗試從整個(gè)圖像中消除自發(fā)熒光[1]。但要注意的是，計(jì)算方法可能很復(fù)雜。有許多不同的方法和算法可供選擇，所以可以嘗試查看哪些方法效果最好。重要的是要記住，這些方法往往會(huì)降低您的熒光體信號(hào)的強(qiáng)度以及自發(fā)熒光，所以要小心使用它們，并注意在提高與背景的對比度和降低信號(hào)強(qiáng)度之間進(jìn)行權(quán)衡。

固定后去除自發(fā)熒光
準(zhǔn)備好您的樣品并儲(chǔ)存在冰箱后，似乎任何自發(fā)熒光都會(huì)留在那里。雖然在樣品準(zhǔn)備階段消除自發(fā)熒光比較容易，但即使在這個(gè)過程的后期階段也肯定可以采取一些步驟。

有許多化學(xué)處理方法可以減弱自發(fā)熒光信號(hào)。其中一些是市面上可以買到的，而另一些則可以用普通的實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品輕松制備，如硼氫化鈉、蘇丹黑B、乙醇銨等[2,3]。

光漂白在顯微鏡中往往有負(fù)面的含義，在激光調(diào)得稍高的情況下，往往會(huì)在花費(fèi)大量時(shí)間尋找最佳圖像后失去熒光信號(hào)。然而，對于自發(fā)熒光，漂白可以發(fā)揮有益的幫助。在添加熒光團(tuán)之前，您可以用高強(qiáng)度LED光處理您的樣品，以漂白所有的背景自發(fā)熒光。之后，您所選擇的熒光標(biāo)記應(yīng)該與漂白后的背景形成更強(qiáng)烈的對比[4]。

消除自發(fā)熒光的先進(jìn)方法

顯微鏡和熒光標(biāo)記技術(shù)在不斷進(jìn)步的同時(shí)也考慮到了自發(fā)熒光。有兩項(xiàng)創(chuàng)新在商業(yè)共聚焦顯微鏡中正變得越來越容易使用。

白光激
在減少自發(fā)熒光方面，白激光（WLL）具有很大的靈活性。首先，它們使您能夠精細(xì)地調(diào)整激發(fā)波長，以匹配您所選擇的熒光團(tuán)，同時(shí)補(bǔ)充您的樣品的自發(fā)熒光特征。

白激光在選擇熒光團(tuán)時(shí)也給您大的靈活性，因?yàn)槔碚撋纤鼈兛梢宰屇�在整個(gè)光譜范圍內(nèi)使用所有已知的熒光染料。波長從440 nm一直到遠(yuǎn)紅端（790 nm），在處理自發(fā)熒光時(shí)，激發(fā)新型遠(yuǎn)紅熒光標(biāo)記的能力特別有利，因?yàn)樽园l(fā)熒光更常見于光譜的藍(lán)色和綠色帶。

最后，基于光纖的WLL技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)脈沖激發(fā)，因此，您可以在脈沖之間的非常短的間隔內(nèi)記錄熒光信號(hào)（計(jì)數(shù)光子）。這是時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）的一個(gè)基本要求--熒光壽命分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法。有了WLL，F(xiàn)LIM可以內(nèi)置于您的顯微鏡中，為減少自發(fā)熒光和提高圖像對比度提供了一個(gè)非常有效和相對簡單的方法。

壽命成像
熒光壽命成像方法可用于消除自發(fā)熒光。壽命測量不是僅僅依靠特定波長下的熒光強(qiáng)度，而是反映熒光團(tuán)在激發(fā)狀態(tài)下所花費(fèi)的時(shí)間，這通常是納秒級(jí)的時(shí)間。這可以發(fā)揮重要的作用，因?yàn)槟�的背景自發(fā)熒光和您的熒光標(biāo)記有重疊光譜的幾率相對較高。然而，它們具有相同的壽命信號(hào)的幾率要小得多。這意味著壽命測量可以用來區(qū)分自發(fā)熒光和熒光標(biāo)記信號(hào)，即使它們看起來在同一光譜范圍內(nèi)。以這種方式區(qū)分熒光信號(hào)，意味著使用壽命測量可以從幾乎任何熒光信號(hào)中收集有意義的信息，甚至是自發(fā)熒光。雖然壽命測量在傳統(tǒng)上是一種相對復(fù)雜的技術(shù)，但硬件和軟件的改進(jìn)使其更容易被納入任何共聚焦顯微鏡的工作流程。

圖2：左邊的熒光顯微鏡圖像，沒有區(qū)分熒光信號(hào)和背景自發(fā)熒光。右邊的圖像使用FLIM來區(qū)分葉綠體中的自發(fā)熒光（藍(lán)色）和來自細(xì)胞膜的理想熒光信號(hào)（綠色）。

概述和結(jié)論

自發(fā)熒光不一定會(huì)毀掉您的實(shí)驗(yàn)。
但當(dāng)您只有有限數(shù)量的珍貴樣本時(shí)，應(yīng)確保沒有任何東西會(huì)損害您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。自發(fā)熒光是一種足以破壞您實(shí)驗(yàn)的常見現(xiàn)象。然而，從簡單地替換您在樣品中使用的介質(zhì)一直到使用先進(jìn)的顯微鏡和檢測器，有許多種方法可以解決自發(fā)熒光。
針對自發(fā)熒光做好相關(guān)準(zhǔn)備是防止它影響您的實(shí)驗(yàn)的最好方法。通過采取相關(guān)的應(yīng)對措施，您可以在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中做出選擇，減少或完全消除背景熒光。

了解更多：徠卡顯微

參考文獻(xiàn)

1，J. M. Powell, N. W. Plummer, E. L. Scappini, C. J. Tucker and a. P. Jensen, „DEFiNE: A Method for Enhancement and Quantification of Fluorescently Labeled Axons,“ Front Neuroanat, 2018.
2，W. Baschong, R. Suetterlin and R. Laeng, „Control of autofluorescence of archival formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue in confocal laser scanning microscopy (CLSM).,“ J Histochem Cytochem, vol. 49, no. 12, 2001.
3，M. Viegas, T. Martins, F. Seco and A. do Carmo, „An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues.,“ Eur J Histochem, vol. 51, no. 1, 2007.
4，S. Y, I. P and C. A, „Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.,“ J Vis Exp, no. 127, 2017.