液相改善峰形與提升分離度相關(guān)的知識(shí)

　　"良好的分離度與定量的準(zhǔn)確性密切相關(guān)。“昨天的分離度不太行呀，流動(dòng)相要再調(diào)調(diào)!”這話是不是很熟悉?調(diào)調(diào)?!咋調(diào)?如果不知道如何配制合適的流動(dòng)相請(qǐng)看過來!今天小編為大家整理了液相改善峰形與提升分離度相關(guān)的知識(shí)，僅供大家參考~"
 

　　秘訣1：由強(qiáng)到弱

　　一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
 

　　秘訣2：三倍規(guī)則

　　每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。
 

　　秘訣3：粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

　　當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。
 

　　解決辦法

　　1. 流動(dòng)相的性質(zhì)要求一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

　　選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：

　�、� 流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。

　　堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

　�、� 純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。

　�、� 必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。

　�、� 粘度要低(應(yīng)<2cp)。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。

　�、� 對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。

　　⑥ 樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
 

　　2. 流動(dòng)相的pH值

　　采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在;對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液;分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

　　注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺(如三乙胺)又稱為減尾劑或除尾劑。 (三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個(gè)乙基取代的產(chǎn)物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發(fā)的無色液體，有氨的氣味。熔點(diǎn)-114.7℃，沸點(diǎn)89.3℃，相對(duì)密度0.7275(20/4℃)。溶于水和乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。三乙胺有堿性，與無機(jī)酸能生成易溶于水的鹽類�？捎蒒，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應(yīng)制取，也可用乙醇胺進(jìn)行氣相烷基化反應(yīng)合成。用于制橡膠硫化促進(jìn)劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用于合成四級(jí)銨化合物)。
 

　　3. 如何選擇緩沖液PH值

　　在選擇緩沖液PH值之前，應(yīng)先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個(gè)PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知，溶液PH值高于或低于Pka兩個(gè)單位，化合物中99%以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉(zhuǎn)變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上由HH公示得知，當(dāng)溶液PH值等于2.2時(shí)，99%的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2時(shí)99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當(dāng)緩沖液PH值等于2.2時(shí)，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱。 當(dāng)化合物只有氨基時(shí)，緩沖體系的選擇十分簡單，大多數(shù)氨基化合物在PH值小于9時(shí)都被質(zhì)子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均適合應(yīng)用，你也許會(huì)問水的PH值大約是7，為什么還用緩沖鹽，因?yàn)榫彌_鹽有助于增加方法的可靠性，以及色譜峰的尖銳性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的減弱，減小化合物與硅膠表面硅羥基的作用，而使峰更尖銳，任何緩沖液均可應(yīng)用于氨基化合物的分析，但我們認(rèn)為PH值等于3的磷酸鉀鹽最適合用于氨基化合物的分析。 在上面兩個(gè)例子中，PH=3的磷酸鉀鹽都能獲得良好的應(yīng)用，在一般情況下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的緩沖液，并且我們認(rèn)為在氨基化合物分析中鉀鹽比鈉鹽更好。
 

　　4. 流動(dòng)相的脫氣

　　HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。(噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng))。

　　此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相(如烷基胺)反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑(如甲醇、四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收(特別是在260nm以下)，并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰(假峰)。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測中(特別是還原電化學(xué)法)，氧的影響更大。 除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。 對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。 超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了(一般500ml溶液需超聲20~30min方可)，此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。 離線(系統(tǒng)外)脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。 在線(系統(tǒng)內(nèi))脫氣法無此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體(通常是氦)將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機(jī)。 一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
 

　　5. 流動(dòng)相的濾過

　　所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45µm(或0.22µm)濾過，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純?cè)噭┮膊焕��?除非在標(biāo)簽上標(biāo)明“已濾過”)。用濾膜過濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相(脂溶性)濾膜和水相(水溶性)濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。

　　水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會(huì)被溶解!溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。

　　對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，首選有機(jī)相濾膜�，F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。 磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。
 

　　6. 鹵代有機(jī)溶劑

　　應(yīng)特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑(如CCl4、CHCl3等)與各種醚類(如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等)混合后，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。

　　此外，鹵代溶劑(如CH2Cl2)與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑(如乙腈)混合靜置時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶�？傊�，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會(huì)產(chǎn)生類似問題。