免疫組化技術專題第4期：固定、浸蠟和烤片的操作步驟及注意事項
免疫組化的染片結果影響著病理診斷的判讀。但是免疫組化染色流程操作復雜，其中需要經過切片制作（固定，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，貼片，烤片）、脫蠟、水化、阻斷、抗原修復等上十余種操作步驟，在每一步操作步驟中，都可能存在影響免疫組化染色結果的因素。本期我們將講解切片制作步驟中的固定、浸蠟和烤片，對免疫組化染色結果的影響。 固定 及時、充分的固定是高質量免疫組化染色結果的保證。固定是為了最大限度地保存組織內部的抗原性。
固定原則：在保持細胞形態和所測抗原性的前提下，采用盡可能低濃度的固定液和最短固定時間，要求組織離體后盡快放入固定液或低溫保存，并針對抗原特性選擇最合適的固定劑。
固定液的選擇：目前最佳的免疫組化固定劑是FineFIX 固定液。雖然10%緩沖甲醛/溶液或多聚甲醛最為常用，其可做抗原修復，但甲醛對保存IgG抗原方面較差。
另外樣本組織塊在前處理階段的不當操作會導致內部抗原發生改變，從而導致染色強度的強弱或陽性表達率減少的狀況層出不窮。首先考慮的是浸蠟溫度，和烤片溫度的影響。 烤片 烤片的目的，一是方便脫蠟，二是將組織切片牢固地附貼于玻片上，以防止在整個染色過程中出現脫片情況，以及能讓經烤片后的組織切片中的免疫反應活性能在常溫下保存長久。
實驗表明，浸蠟溫度在80℃超過16小時的組織在免疫組化染色表達時，其陽性表達及陽性率均有明顯的減少。以下是各類常見組織適宜的烤片溫度及烤片時間參考：
固定原則：在保持細胞形態和所測抗原性的前提下，采用盡可能低濃度的固定液和最短固定時間，要求組織離體后盡快放入固定液或低溫保存，并針對抗原特性選擇最合適的固定劑。
固定液的選擇：目前最佳的免疫組化固定劑是FineFIX 固定液。雖然10%緩沖甲醛/溶液或多聚甲醛最為常用，其可做抗原修復，但甲醛對保存IgG抗原方面較差。
另外樣本組織塊在前處理階段的不當操作會導致內部抗原發生改變，從而導致染色強度的強弱或陽性表達率減少的狀況層出不窮。首先考慮的是浸蠟溫度，和烤片溫度的影響。 烤片 烤片的目的，一是方便脫蠟，二是將組織切片牢固地附貼于玻片上，以防止在整個染色過程中出現脫片情況，以及能讓經烤片后的組織切片中的免疫反應活性能在常溫下保存長久。
實驗表明，浸蠟溫度在80℃超過16小時的組織在免疫組化染色表達時，其陽性表達及陽性率均有明顯的減少。以下是各類常見組織適宜的烤片溫度及烤片時間參考：
浸蠟
在實驗中不難發現，組織浸蠟的溫度及時間長短對免疫組化染色結果的影響并沒有像烤片那么大，這與組織浸蠟時一般為隔水加溫法有關。文獻報道當因高溫浸蠟影響了免疫組化反應活性時，在免疫染色前用1%硫酸鋅水溶液加以處理能夠得到完全恢復。
經實驗結果證實，組織切片在55~60℃溫度下烤片，時間小于 16 小時，不會影響大多數抗原活性的保存。但免疫組化染色是一個復雜的過程，從用作免疫組化檢測的組織塊的制備到免疫染色的本身程序上均有可能引起抗原或多或少的丟失。因此，測試在所有的免疫組化染色過程中可能出現的影響免疫活性的原因都有必要。
【參考文獻】
病理技術大講堂1001問-病理技術操作疑難點解惑答疑. 席越，陳軍主編.人民衛生出版社
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