SmartBatch+ 主動式組織透明化及染色一體機使用流程指南
SmartBatch+主動式組織透明化及染色一體機是基于Lifecanvas公司最新研發(fā)的Clear+透明化系統(tǒng)迭代設計而成，高度融合原有一代主動式組織透明化SmartClear系統(tǒng)和主動式免疫標記SmartLabel系統(tǒng)所有功能，是一臺功能高度集約、高通量的快速主動式透明化染色一體化設備。用SHIELD方法透明化及染色的具體流程：（其它方法也有用到SmartBatch+一體機的，例如cubic透明化后，用其染色。此處用SHIELD方法為例來闡述SmartBatch+一體機的使用方法）
一. SHIELD固定
制備樣本，以下操作都注意遮光，可用錫箔紙包裹
2. 4°C下振蕩孵育。（小鼠腦20mL孵育3天，大鼠腦50mL孵育6天）
3. 將SHIEID ON Buffer預熱至 37°C振蕩孵育24h（小鼠腦20mL，大鼠腦40mL），
二. Smart Batch+進行脫脂
1. “Delipidation Buffer（脫脂緩沖液）” 45°C” 24 小時（小鼠腦20mL，大鼠腦40mL）.
2. 一整瓶“Conduction Buffer”倒入樣本倉。35mL “Delipidation Buffer” 加入樣本杯。
3. 樣本上機
4. 打開“Auxiliary Power（輔助電源）”，
5. 打開“Electrophoresis Power（電泳電源）”。
6. 按“Preset（預設）”直到顯示“Clearing Mode（透明化模式）”。
7. 每 2-3 天更新“Delipidation Buffer（脫脂緩沖液）”。
8. 完全脫脂后，樣本下機 ，PBS洗（將樣本放在打光的底透臺上，沒有實心則透明化完成）
9. 清洗儀器
10.（不染色的話50% EasyIndex 24h，37°C ；100% EasyIndex 24h,37°C包膠成像）染色則不進行此步驟
三.Smart Batch+進行免疫標記
實驗：Day0 預孵育:
室溫“Primary Sample Buffer過夜。
實驗：Day1 一抗標記：
1. 樣本上機。
2. 一整瓶“Primary Device Buffer”倒入樣本倉。
“Primary Sample Buffer” 倒入樣本杯，
3. 按照要求添加抗體、血清。
4. 將“Timer（定時器）”設為 18 小時。
5. 打開“Auxiliary Power（輔助電源）、“Electrophoresis Power（電泳電源）”和“Timed Shutdown（定時關機）”。
6. 按“Preset（預設）”，直到它顯示“Labeling 1 （一抗標記）”
實驗：Day2一抗洗滌和固定：
1. PH<8,下機（不小于8則延長下機時間）
2. PBS洗8h,每兩個小時更換一次PBS。
3. 4%PFA室溫振蕩過夜
實驗：Day3 PFA洗滌及二抗順序標記
1. 被動洗滌6-8h，中間更換一次溶液，37°C
2. 按照要求添加二抗，Time設定為12h 。
3． 打開“Auxiliary Power（輔助電源），“Electrophoresis Power（電泳電源）”，打開“Timed Shutdown（定時關機）”,“Preset（預設）”，直到它顯示“Labeling 2。
實驗：Day4 二抗洗滌及PFA固定
二抗洗滌
1．“Secondary Sample Buffer（SS#緩沖液）”裝滿樣本杯
2. 將“Timer（定時器）”更改為 6 h,中間更換一次溶液。
3. 打開“Auxiliary Power（輔助電源），“Electrophoresis Power（電泳電源）”，打開“Timed Shutdown（定時關機）”。
4. 清洗設備，將樣本放入PBS中室溫振蕩
PFA固定
1. PBS洗。4% PFA固定二抗 室溫振蕩過夜。
2. PBS 洗，更換一次溶液。
3. 您已經(jīng)完成染色了！現(xiàn)在可以準備開始進行 折射率匹配 。
四.折射率匹配實現(xiàn)樣本光學透明
本實驗方案需要使用 RI = 1.52 版本的 EasyIndex 。
1. 使用前最好將EasyIndex 過濾，消除里面的雜質(zhì)。
2. 50% EasyIndex + 50% 蒸餾水中， 室溫或37°C 下振蕩孵育，過夜
3. 100% EasyIndex， 室溫或37°C 下振蕩孵育，過夜。
如果始終無法透明，則沒有完全脫脂，只需將 EasyIndex 清洗掉并進一步透明化即可。
五.包膠
六.LS18 Plus快速高分辨光片顯微成像
七. 專業(yè)的三維圖像處理及分析
SmartBatch+ 主動式組織透明化及染色一體機主要是在SHIELD固定后的脫脂和染色的步驟中應用，脫脂和染色極其重要，因此我們要嚴格按照步驟，小心操作。按照步驟中的要求，掌握好相應的試劑，溫度以及時間，其中SmartBatch+簡單快捷的操作，大大減少了使用者的工作量。
SmartBatch+不僅操作方便，而且容量大，可以12個小腦一起上機，適合批量處理，效果明顯優(yōu)于不上機處理的樣本。可以自動定時關閉，不用嚴格按照時間進出實驗室，使用者可以更加便捷的開展實驗。
SHIELD固定，透明化及染色的實驗流程
|
日期 |
時間 |
步驟 |
|
星期五 |
上午9:00 |
SHIELD-Off |
|
星期一 |
上午9:00 |
SHIELD-On |
|
星期二 |
上午9:00 |
脫脂液（Delipidation Buffer）孵育 |
|
星期三 |
上午9:00 |
在SmartBatch+中進行透明化 |
|
星期四 |
上午9:00 |
PBSN洗滌 |
|
星期五 |
下午5:00 |
一抗緩沖液孵浴（Primary Sample buffer）孵育 |
|
星期一 |
上午9:00 |
更換一抗緩沖液孵育（Primary Sample buffer） |
|
下午3:00 |
開始一抗染色 |
|
|
星期二 |
上午9:00 |
檢查PH值（繼續(xù)電泳或者PBSN洗滌） |
|
下午1:00 |
更換PBSN |
|
|
下午5:00 |
PFA固定 |
|
|
星期三 |
上午9:00 |
用二抗緩沖液洗滌 |
|
下午1:00 |
更換二抗緩沖液 |
|
|
下午5:00 |
二抗 |
|
|
星期四 |
上午9:00 |
二抗染色后洗滌 |
|
上午11:00 |
更換緩沖液，繼續(xù)洗滌 |
|
|
下午1:00 |
PBSN洗滌 |
