FV3000共聚焦和微流控實現釀酒酵母單細胞復制壽命檢測
Make it EVIDENT
本期推出【FV3000 Makes Yeast Evident】
東南大學電子科學與工程學院 MEMS教育部重點實驗室
釀酒酵母與復制壽命檢測
細胞及生物體的衰老是一個復雜的生理過程，通常被認為是由分子、細胞和器官的損傷不斷積累造成。
釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），又稱出芽酵母（Budding yeast），作為首個實現完整基因組測序的模式真核細胞，具有繁殖迅速、培養(yǎng)條件簡單、基因組小等優(yōu)點，并且與人類的衰老曲線相似，成為衰老壽命研究的理想模型。
釀酒酵母在死亡之前只能產生有限數量的子細胞，這種現象被稱為復制衰老，而在死亡前產生的子細胞的數量被稱為復制壽命（Replicative Lifespan, RLS）。
B 酵母細胞復制壽命示意圖[2]
酵母細胞復制壽命的傳統測量手段是基于1959年提出的微解剖法，即利用微解剖針手動剔除培養(yǎng)板上單個酵母細胞產生的每代子細胞，從而得到復制壽命。該方法具有效率低、周期長、樣本量小、對細胞易造成損傷等缺點。
而微流控芯片可利用微結構實現酵母單細胞的捕獲，利用流體力剪切去除子細胞，為釀酒酵母自動化高通量單細胞培養(yǎng)和高時空分辨率監(jiān)測提供可能，但有如下局限：
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現有微流控芯片在細胞捕獲穩(wěn)定性、子細胞剪切效率、復制壽命檢測精確性等方面都有待于提高；
- 現有微流控芯片較少關注大體積、隨機出芽的雙倍體酵母細胞的捕獲培養(yǎng)和壽命檢測。
顯微成像技術在課題研究中的作用
東南大學電子科學與工程學院MEMS教育部重點實驗室朱真副教授團隊利用高通量微流控芯片取得了釀酒酵母單細胞復制衰老壽命研究的重要進展，相關研究成果于3月31日以“A high throughput microfluidic diploid yeast long term culturing (DYLC) chip capable of bud reorientation and concerted daughter dissection for replicative lifespan determination”為題，發(fā)表在國際期刊Journal of Nanobiotechnology上（影響因子：10.435，doi：/10.1186/s12951-022-01379-9）。
該論文研制的高通量釀酒酵母單細胞捕獲-培養(yǎng)-解剖微流控芯片，與奧林巴斯FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡雙劍合璧，成功實現對雙倍體釀酒酵母母細胞的可靠捕獲和子細胞的一致性剪切，進而實現穩(wěn)定的長期培養(yǎng)和完整的復制壽命檢測研究。
A 微流控芯片溝道實物圖B 微結構陣列區(qū)實物圖
C母細胞在捕獲結構中帶芽旋轉和子細胞剪切過程示意圖
針對不同“瓶身”長度，時序圖像顯示在母細胞較小時，捕獲結構容易捕獲上游剪切下的細胞。而母細胞接近凋亡時，由于體積增大，子細胞旋轉至“瓶頸”的成功率降低，朝向“瓶身”上游生長的子細胞會將母細胞拖拽造成樣本丟失。根據統計的母細胞穩(wěn)定保持的比例，最終確定“瓶身”長度優(yōu)化值。
A 4小時內微捕獲陣列中的空結構實現“自填充”
B 4小時內單細胞捕獲效率提升
C 較短“瓶身”的捕獲結構，朝向上游的子細胞將母細胞拖拽造成樣本丟失
D 較長“瓶身”的捕獲結構，易捕獲上游剪切下的細胞
接下來，研究人員在高通量單細胞長時間培養(yǎng)過程中，通過視頻拍攝觀測并驗證了母細胞在初始出芽時的動態(tài)旋轉，并在芽稍大時重新定向至“瓶頸”處，且停止旋轉直到胞質分裂完成后被解剖分離。通過時序成像，驗證了母細胞在多代子細胞之間，面臨隨機的出芽位點依然能夠實現穩(wěn)定的“瓶頸”定向和子細胞剪切。
視頻2：母細胞在細胞周期內出芽旋轉至成熟子細胞剪切的動態(tài)過程
以10分鐘時間間隔的時序成像過程中，上一代子細胞被成功剪切后下一代芽隨即旋轉至“瓶頸”中（三個樣本分別為相鄰出芽、相對出芽、隨機出芽三種模式）。最終測定實驗的雙倍體菌株的復制壽命為24.29±3.65代。實驗人員統計了不同時間點下，母細胞所產生的子細胞被空捕獲結構所捕獲后測定的壽命。擬合曲線顯示壽命較大的母細胞所產生的子代壽命會縮短。
同時，釀酒酵母的細胞周期在其壽命內的分布也呈現一定規(guī)律。細胞在完成第一個細胞周期的用時比接下來5代用時略長，而接下來的復制壽命里，各代周期皆相對平穩(wěn)，只在臨近死亡的最后幾代中急劇上升。選取樣本并將其每個細胞周期使用不同顏色的長條標出，從而將細胞群體間的異步化結果變得可視化。
結果表明，細胞在前8至10代以內，細胞周期在細胞相互間保持有相對的同步性，隨著細胞不斷衰老，細胞間的異質化現象逐漸明顯。臨近細胞死亡時，細胞的周期被拉長，且細胞間差異逐漸擴大。
視頻3：單個釀酒酵母細胞復制壽命的時序監(jiān)測
A 雙倍體釀酒酵母細胞的復制壽命曲線
B 不同時間點下，母細胞所產生的子細胞被空捕獲結構捕獲后的復制壽命
C 釀酒酵母細胞的平均細胞周期（出生對齊）
D 釀酒酵母細胞的平均細胞周期（死亡對齊）
E 細胞周期分布圖
該研究后續(xù)工作包括利用卷積神經網絡深度學習算法實現酵母細胞的復制壽命、細胞周期、生長速率等關鍵生理指征參數的高效智能分析，成功解決酵母細胞衰老過程中的表型分析問題，為釀酒酵母復制壽命及其衰老相關形態(tài)變化完整關聯性圖譜的構建提供可能，并在雜合性缺失、沉默信息調控等雙倍體細胞獨有的壽命調控模式研究上具有廣泛的前景。
在成像樣品制備以及圖像采集中的注意事項
實驗過程中，我們設定了每隔10分鐘對導航圖內各典型區(qū)域一次成像。此外，FV3000系統配備了z軸防漂移系統，可持續(xù)鎖定焦平面，在長達3天的長時程成像中保證了焦面的穩(wěn)定。FV3000的導航圖和長時程鎖焦功能，優(yōu)化了我們的圖像采集工作流程，為實驗提供了便利性，保證了穩(wěn)定可靠的實驗數據的獲取。
參考文獻
[1] Smith, J., Wright, J., & Schneider, B. L. (2015). A budding yeast's perspective on aging: The shape I'm in. Exp Biol Med, 240(6), 701-710.
[2] Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H. E. W., Lee, L. P., & Heinemann, M. (2012). Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci USA, 109(13), 4916-4920.
