高效液相色譜儀日常維護的方法與步驟

具體維護內容

1.流動相

1.1溶劑瓶

a) 棕色玻璃瓶會避免藻類的生長，適用于盛放水及緩沖液相;

b) 流動相應經過0.45um或更小孔徑的濾器過濾(Waters UPLC使用0.22μm濾膜過濾)，以免其中微粒性阻塞毛細管，使用濾膜時區別使用有機膜與水膜。

1.2流動相效期的管理

a) 流動相為純有機相的效期為1個月(長時間使用時注意溶液狀態，使用前觀察是否有絮狀物，瓶體有無沉淀，下同);

b) 有機相比例≥50%，效期為3周;有機相比例為20%~50%效期為2周;有機相比例≤20%效期為1周(長時間使用時注意溶液狀態);

c) 不含有機相的緩沖鹽效期為3天

d) 純化水當天配置、使用

1.3溶劑過濾器

Ⅰ溶劑過濾器檢查方法

a) 擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，并使液面高于出口30cm此時溶劑會因為重力流出，脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出。

b) 查看過濾器是否變色。

c) 臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常。

 

a) 玻璃濾頭：將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，先用水沖洗殘留溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸溶液(35%)的燒杯里浸一小時，純水徹底沖洗過濾器。嚴禁使用超聲波清洗機清洗，將過濾器重新裝好，僅適用于Agilent液相。

b) 金屬濾頭：將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，先用水沖洗殘留溶劑，然后將過濾器放在50%異丙醇溶液的燒杯里超聲清洗30分鐘，再使用純水超聲清洗2次(每次20min)，清洗后將過濾器重新裝好，適用于Thermo Fisher、Shimadzu、Waters液相。

維護周期：建議每月清洗一次，長時間使用緩沖鹽可適當提高清洗頻率。

2.脫氣機

2.1工作原理

真空脫氣機由一個四通道真空箱和一個真空泵，壓力傳感器及控制電路構成。

溶劑瓶中的溶劑在泵的抽動下流過真空箱內的特殊管狀塑料膜。當溶劑經過真空管時，溶劑中溶解的氣體將滲過塑料膜進入真空箱。到達真空脫氣機出口時，溶劑幾乎已被完全脫氣而不含有任何氣體。

2.1脫氣機脫氣狀況判斷方法

打開Purge閥(Waters UPLC可設置為灌注溶劑狀態)，設定泵的流速2ml/min，提起當前所使用溶劑瓶內的溶劑過濾頭，使之脫離液面一小段時間，此時溶劑傳送管內會產生一小段氣泡，放下過濾頭，讓此段氣泡通過脫氣機，如果脫氣機正常，氣泡應消失或縮小。

2.2清洗在線脫氣機及比例閥方法

在長期使用水相或緩沖鹽的通路，使用純水沖洗后，再使用甲醇沖洗，可以打開Purge閥，使用5ml/min的流速(Waters UPLC可設置為灌注溶劑狀態) 。污染比較嚴重時，可以使用異丙醇清洗。

3.四元/二元泵模塊

3.1溶劑比例閥

3.1.1分類

Ⅰ)垂直式比例閥：垂直放置于四元泵中，如Agilent、Thermo Fisher液相。

Thermo Fisher U-3000溶劑比例閥

比例閥A、D通道位于上側，B、C位于比例閥下側。因此建議將A通道放入有機相多的溶劑中;B通道放入水相或緩沖液中;C通道放入純有機相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D通道固定放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑及洗針和灌注注射器。

Agilent 1260溶劑比例閥

比例閥位置是A、D通道位于下側，B、C位于比例閥上側。因此建議將A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機相多的溶劑;C通道放入純有機相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑。

Ⅱ)水平式比例閥：水平放置于四元泵中，如Waters，Shimadzu液相

水平式比例閥使用

建議通道使用情況與安捷倫一致，A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機相多的溶劑;C通道放入純有機相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑。

Ⅲ)二元泵因只有兩個通道，建議A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機相多的溶劑。

3.1.2溶劑比例閥串液判斷方法

使用兩通連接系統，設定泵的流速1ml/min，每個通道各占25%流量，提起所有通道的溶劑過濾頭，使之脫離液面一小段時間，此時溶劑傳送管內會產生一小段氣泡，放下過濾頭，當氣泡至管線中間位置時，關閉流速，在氣泡處標記，只開其中一個通道流速觀察其他三個通道氣泡位置變化，若無變化，則該通道無串液問題，反之存在串液問題，同理檢查其他通道是否存在問題。

3.2柱塞密封清洗

a) 當泵頭安裝有清洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力，所以開泵前一定先用密封清洗液沖洗柱塞密封墊，濕潤柱塞桿。

b) 建議使用10%異丙醇水溶液(或10%甲醇水溶液)作為密封清洗液，10%異丙醇水溶液(或10%甲醇水溶液)有助于降低水的表面張力，提高潤濕效率，快速溶解析出鹽，并有抑菌作用，有效期為兩周。

c) 實驗開始前確保柱塞密封清洗功能已打開，清洗液不可循環使用，隨時觀察泵清洗液是否充足，及時添加泵清洗液。

d) 柱塞密封清洗方法

Thermo Fisher、Waters液相內置程序自動開啟;

Agilent需要手動打開，設置定期清洗每30min清洗0.1min;

Shimadzu液相需要手動清洗，使用的島津液相每天使用注射器吸取清洗液沖洗2 min。

4.進樣系統

4.1自動洗針功能

吸取樣品時，進樣閥處于旁路位置，自動洗針可以立即洗去針外表面上殘留的樣品，當進樣閥轉回到主流路時，定量管和針內所有的樣品都被沖洗到色譜柱中。這種結合洗針和沖洗管路的設計可以把攜留效應減低到最小的程度。

Thermo Fisher、Waters、Shimadzu及AgilentⅡ代液相的自動洗針功能，連接專門通路，自動填充溶劑清洗;AgilentⅠ代液相采用在液相小瓶中清洗的方式，需要設置清洗小瓶位置并且去掉小瓶的蓋墊，防止少量樣品留在密封墊上，造成污染。

洗針液以能溶解待測樣品為宜，可有效減少殘留污染。建議使用10%的甲醇或乙腈作為洗針液，Thermo Fisher液相使用D通道，即10%乙腈作為洗針液，對于特殊樣品需要配制專門溶劑。

4.2計量裝置

a)Thermo Fisher、Waters、Shimadzu液相采用計量注射器量取樣品液，在運行前需要灌注注射器以排除注射器內氣泡，以防計量不準;

b)Agilent液相采用計量泵方式，無注射器不需灌注。

 

 

5色譜柱

反相色譜柱維護，通常使用純水和有機溶劑，水主要是作為沖洗掉色譜柱中的鹽和其他添加劑，而有機溶劑則是用來沖洗掉一些在色譜柱上有較強保留的污染物;

完全置換色譜柱中的流動相，需要至少十倍柱體積，一根常用的4.6×150mm和4.6×250mm的色譜柱柱體積大約分別是1.5mL、2.5ml，按照常用的1mL/min的流速，分別至少需要15min、25min的時間。

6紫外檢測器

 

 

6.1流通池的清洗

在不連接色譜柱的情況下先用高純水沖洗20分鐘，然后用異丙醇(或5%硝酸，流通池污染嚴重時采用，慎用))沖洗2小時，最后用高純水沖洗，可根據污染情況調整沖洗時間，若正常沖洗無效，反沖檢測器。適用于VWD、DAD的流通池。

6.2流通池耐壓

注意不同檢測器流通池耐壓問題，盡量避免使用pH>9.5的流動相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動相，防止流通池堵塞;VWD 40bar，DAD 120bar，MWD 120bar，FLD熒光 20bar，RID 示差5bar，RID、FLD永遠是最后一個檢測器。

6.3檢測器燈維護

檢測器的燈一般在流通池有溶液連續流出幾分鐘后再開啟，若流通池中有氣泡，則會提示漂移過大無法通過自檢和校正;

檢測器的氘燈或鎢燈不可經常關閉，每開關一次燈的壽命損失約30小時，若儀器中途不需做樣，可設置低流速，長時間不使用可關機。

7色譜系統

7.1儀器的過渡及流動相的過渡處理

a)使用儀器前，使用10%乙腈沖洗系統10~30min，當流動相含緩沖鹽時，連接色譜柱，繼續使用10%乙腈沖洗系統約20min(根據柱體積來確定過度時間，至少10倍柱體積)，以置換色譜柱內保存液;

b)Purge注意事項

更換所需流動相，若流動相分別使用緩沖鹽和純有機相兩個通道時，當purge完其中一個通道后，使用10%乙腈purge 2 min左右，再purge另外的一個通道，放置防止水相與有機相在比例閥至泵后管路中混合產生結晶堵塞管路;將兩通道比例設置完成后關閉purge閥，開始平衡色譜柱;

c)儀器使用后，首先將使用到的管路放入10%乙腈中，使用10%乙腈沖洗色譜系統30~50min，更換為90%乙腈沖洗30min，使用兩通替換色譜柱，將四個通道放入10%乙腈中或50%異丙醇中沖洗保存。

7.2儀器的清洗維護

a)液相的四個通道使用50%異丙醇沖洗過夜，在沖洗過程中每隔一段時間切換進樣閥的主路和旁路，用于清洗六通閥，長時間未清洗的儀器可以適當提高異丙醇比例。

b)當進樣的樣品濃度較高時，設置洗針序列，進樣10%有機相(可根據樣品溶解度選擇合適的洗液，一般不含鹽)，兩分鐘進樣一次，運行10針以上，可以沖洗干凈。

7.3色譜用溶液、溶劑污染防范

a)各(色譜)試劑只能倒出，不得用器具移取或者將剩余倒回;

b)將甲醇、乙腈可倒入小體積溶劑瓶或燒杯中，方便使用且避免污染;

c)當稀釋劑中含有機相時，避免使用塑料滴管，防止有機相溶解塑料在色譜系統中產生鬼峰;

d)溶劑瓶注意封口，當兩個通道放入一個瓶中時，使用封口膜密封，防止異物(注意封口膜老化掉入)落入其中。

7.4捕集小柱使用注意

捕集小柱可有效避免流動相中的雜質對基線的干擾，主要應用于梯度洗脫體系中;

沖洗過渡色譜系統后，首先使用梯度流動相中有機相比例最大的比例沖洗系統至基線平衡，再更換為初始比例，時間為梯度中設置的平衡時間，不管是否平衡，立即運行序列，空白進至少3針保證系統平衡。

7.5常見問題解析

保留時間不穩定

a)首先觀察保留時間是否有規律的變化，并同時觀察壓力是否穩定;

b)若壓力穩定而保留時間呈有規律變化，多數是色譜柱未平衡好，特別是含有鹽的流動相，需較長的時間去平衡;

c)若壓力穩定而保留時間無規律變化，請檢查溶劑過濾頭及真空腔是否有堵塞，再平衡色譜柱足夠時間，如仍然不佳，可更換一色譜柱;

d)若壓力不穩定，請檢查造成壓力不穩定的因素，如：漏液，排液時間不足夠，鹽濃度過高導致鹽析，主動閥比例閥內漏等。

峰面積重現性不好

a)首先觀察壓力是否穩定，以及觀察峰面積變化是否有規律。

b)若壓力不穩定，請檢查造成壓力不穩定的因素，如漏液，排液時間不足夠，鹽濃度過高導致鹽析，主動閥比例閥內漏等;

c)若壓力穩定但峰面積呈無規律變化。請檢查樣品是否足夠，確認樣品的穩定性，必要時重新配制，檢查進樣閥是否漏液等;

d)若壓力穩定且峰面積呈規律變化，多數為色譜柱未平衡好。

基線不穩定

a)基線漂移

色譜柱未平衡好，柱溫未穩定，流動相變化等。

b)基線噪音

流動池有氣泡，流通池污染;

色譜柱和或系統受污染;

燈能量不足，光路臟;

外界因素影響，如電源，溫度和濕度、震動等。