共聚焦顯微鏡的成像原理及應用

什么是共聚焦顯微鏡？
共聚焦顯微鏡是激光共聚焦掃描顯微鏡 LCSM 的簡稱，它顯微成像主要采用 3D 捕獲的成像技術，使其具有較高的三維圖像分辨率。這 些都是 通過構建顯微照片來實現的。在熒光顯微鏡使用過程中，由于需要高強度紫外光輔助成像，所以顯微鏡 內的汞弧燈產生的強光可能會導致令人不安的背景噪音，甚至會導致光漂白。 共聚焦顯微鏡原理是通過數碼相機針孔的高強度激光來實現數字成像的技術，有效避免了熒光顯微鏡 所產生 的問題。

共焦顯微鏡原理
共聚焦顯微鏡中的圖像是來自一個焦平面的光通過針孔數碼相機聚焦拍攝，從而規避 來自其支點上方或下方的光。固定在設備上的激光連續聚焦在樣品的選定區域，同時，被樣品吸附的熒光染料也會被數碼相機捕捉。共聚焦設備包含兩個旋轉鏡頭用來拍攝組圖。

然后通過所累積的不同焦平面的圖像序列，使用軟件編譯完整的 3d 圖像。此圖像可以在軸向（z 軸）和橫向（x 和 y 軸）平面進行微調。這些細胞和其他矩陣的再現是通過使用雙倒置的光錐照亮物體來實現的。

使用標準落射熒光顯微鏡所存在的問題是當遇到較厚的基質或標本時所表現出的熒光程度較大。大于 2 微米的樣品發出的輻射會危及生成圖像的準確性，從而損失成像的細節。而共聚焦顯微鏡則可以通過縮小激發范圍并使用光學切片來消除背景噪聲。



共聚焦顯微鏡的應用 

ECM模擬凝膠的成像
細胞外基質 (ECM) 或屬于所有細胞的非細胞成分，在細胞功能中是必不可少的。ECM 的彈性調節細胞的許多生物學功能，例如間充質干細胞的分化、粘附和遷移。

細胞生物學中常常通過水凝膠來模擬ECM。共聚焦顯微鏡的應用主要在于可與聚丙烯酰胺凝膠的壓痕法結合使用。共聚焦自動圖像成像可以有效測量 ECM 模擬中的壓痕和穿孔。比如，共聚焦激光顯微鏡可以測量出 PAAM 凝膠組合物的深度和剛度。這種方法可以替代 AFM 納米壓痕法和微針法。
由于共焦成像可以可靠地探測大多數樣品表面下方 0-200 µm 之間的任何位置。然而，重要的是要注意，每個樣本都有自己指定的深度，在該深度處散射、光漂白和噪聲太高。據說有些標本應該完全避免使用共聚焦顯微鏡。

替代雙光子顯微鏡功能 
雙光子顯微鏡或多光子顯微鏡產生兩個光子來完成一個光子的工作。當獲取兩個光子，每個光子具有一半的能量，快速連續退出時，這個過程將取決于撞擊樣品的光強度的平方。

以大約 100 MHz 脈沖的紅外激光器將使失焦光比聚焦光暗得多。

雙光子顯微鏡的散射光不會激發熒光，因為它使用的紅外波比高強度激光散射的少。這將較大程度地減少信號損失并可以穿透大約 1 mm 的組織，超過共聚焦顯微鏡穿透 200 μm 組織的能力。較低能量的紅外光對細胞造成的損害也會降低。

根據電子顯微鏡的成像規則，我們可以知道共聚焦顯微鏡的分辨率遠高于雙光子顯微鏡。雖然，共焦顯微鏡比傳統的熒光顯微鏡要強大得多，但雙光子顯微鏡和透射電子顯微鏡的市場應用更為普遍。