共聚焦原理解析（一）：針孔幾何形狀-完美的四邊形

共聚焦成像的光學切片要求在光路發射部分的場共軛平面上有一個小孔。在最簡單的情況下，這個孔徑為圓形，允許透射出照亮孔徑的艾里衍射圖案的中心部分。孔徑大小應該剛好可以通過該圖案（“艾里斑”）的內圈。因此，孔徑的正確大小取決于波長和物鏡的數值孔徑，因為這些參數也定義了中間像平面中的（放大）衍射圖案。

為了適應不同的顏色和分辨率，檢測針孔應該可變。要獲得精確的圓形孔徑，這意味著在機械設備上提供一組孔徑，以便在需要時可以改變大小。大多數共聚焦顯微鏡使用一種可調諧針孔代替，通常為雙葉片“虹膜”。因此，孔徑不是圓形，而是矩形（正方形）。

有人認為，六角形針孔（使用三枚葉片）在傳遞焦點信息方面會更有效，因為它可以覆蓋較大部分的圓形[1,2]。

不同幾何形狀的面積
可以通過孔徑的光量顯然取決于孔徑本身的大小。舉例來說，對于圓形孔徑，如果半徑增加，就會透射更多光線。然后，該透光量取決于由半徑r定義的面積A_c：
 
如果孔徑為方形，則面積A_s的計算取決于邊長a：
 
最后，通過邊長s給出六邊形的面積A_h：
 

所有這些計算只需具備中學知識即可。然而，如何比較不同尺寸并無明確規定：例如，你可以比較內接于圓形的六邊形。這種情況下，這些面積的比率為A_c：A_h：A_s = 100：83：64。正方形的面積比六邊形小大約30%。這一結果被用來證明使用六邊形孔徑時，與正方形光圈相比，“亮度提高了30%”。這一聲明來自官方，甚至出現在公開網站上。

同樣的，人們可以使用帶內接圓形的多邊形比較。這種情況，這些面積的比率為A_c：A_h：A_s = 100：110：127，由此我們可以得出結論，使用方形孔徑時，亮度可以提高大約15%。

很明顯，這兩種論述在科學上都站不住腳，會讓讀者陷入迷惑，當然這可能就是這種陳述的目的。

由于通過孔徑的光量取決于面積，因此比較不同尺寸的正確參數是各種幾何形狀的面積。通過非常簡單的數據運算，你可以知道：
 

必須要獲得面積與半徑為r的圓形孔徑相同的多邊形。這一共識在1980年代末就被共聚焦社區所認同（因為這是唯一明智的做法）。

因此，如果正確比較，不同幾何形狀的孔徑將傳輸相同的光量，并且光線分布均勻。
  圖1：用于比較不同幾何形狀孔徑的選項左：內接于圓的多邊形。多邊形的角越多，面積就越大。右：內接于多邊形的圓多邊形的角越多，面積就越小。正確的方法顯示在中間：計算多邊形的邊長，使多邊形面積與圓面積相同。

針孔卷積與PSF
事實上，投射到針孔的光強分布并不均勻，而是由艾里衍射圖案確定。為了找出實際的透光效率，必須將不同幾何形狀和大小孔徑同艾里圖案疊加在一起。例如，圓形和方形針孔需要進行此等操作，其中的獨立參數是長度v_d，該長度v_d默認根據圓形半徑調整，以便產生相同的面積[3]

我們計算了艾里圖案通過各種幾何形狀和大小的孔徑時的光量，以研究其與面積本身的函數關系，這樣更易理解并能進行適當的比較。最簡單的情況是與圓形孔徑的依賴關系，它能夠整合進來的（固定的）艾里圖案的強度分布：
 

以計算多邊形孔徑的強度分布，并用數值方法進行疊加。

圖2清晰表明，至少對于圓形和等邊多邊形，焦距強度與幾何形狀完全無關。差異在大約2%的范圍內變化，六邊形分布在圓形和正方形之間，與預期相同。

因此，關于檢測針孔形狀的焦平面信號傳輸效率（在（1）中稱為“亮度”）的任何結論均沒有任何意義。如果存在差異，則說明比較參數選擇錯誤。
  圖2：通過不同形狀和大小的孔徑傳輸信號的比較。目前使用的幾何形狀包括圓形、方形和六邊形。當用艾里圖案計算照明時，所有幾何形狀都顯示出幾乎相同的對大小的依賴關系，而該大小由孔徑面積決定。

光譜共聚焦中的針孔幾何形狀
如上所示，正多邊形的邊數對聚焦信號的傳輸沒有影響。沒有理由假設對散焦信號也是如此。因此，看起來圓形、方形和六邊形針孔在性能上相同。對于基于濾光片的經典共聚焦顯微鏡來說，這可能是一個合理的結論。用于使用色散元件作為不同發射帶的分離器件的共聚焦顯微鏡時，存在差異。

對于含有色散元件的裝置，其光譜分辨率不僅取決于元件本身的性能，還取決于入射光束的尺寸和幾何形狀。顯然，較大的光束直徑會降低光譜分辨率。我們把記錄光譜的中間像平面（光度計滑塊的位置等）稱為光譜平面。較大的物體會在光譜平面上造成較大的圖像。在光譜平面中的任何給定位置，若物體尺寸較大，更多的顏色將有助于局部強度。因此，光譜探測的一個固有結果是光譜分辨率依賴于針孔大小，因為針孔在光譜平面上成像！

因此，光譜平面中圖像的幾何形狀是針孔（放大后）的衍射圖樣。這些衍射圖案的差別很大，取決于幾何形狀。圓形孔徑會引起眾所周知的艾里圖案，它旋轉對稱。針孔在光譜平面中旋轉不會引起差異。正方形的衍射圖樣并非旋轉對稱，其特征是在邊緣有強烈的波瓣，而強度會由內向外大幅下降。這種效應用來提高共聚焦掃描顯微鏡的光譜分辨率[4]：當針孔在光譜平面內旋轉45°時，中心盤外的大部分光強會被引離探測范圍。光譜平面上的顏色重疊就會大幅減少——在本例中減少了1.5倍。

在使用六邊形針孔的系統中，這種影響要小得多，增益可以忽略不計。

因此，最佳的光譜共聚焦裝置采用一個正確定向的方形針孔。
  圖3：利用相對于色散方向旋轉45°的正方形針孔繪制光路設計圖。這種組合優化了固有的光譜分辨率——任何其他幾何形狀都會損害光譜性能。
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