集光：顯微鏡中數值孔徑的重要性

在試圖區分顯微鏡下觀察到的樣本細節時，數值孔徑（縮寫為‘NA’）是一個重要考慮因素。NA是一個沒有單位的數，與透鏡收集的光角度有關。在計算NA（見下文）時還考慮了介質的折射率，通過將載玻片或細胞培養容器的折射率與浸沒介質相匹配就可以分辨出樣本的更多細節。光從一種介質傳播到另一種介質時的行為方式也與NA有關（稱為“折射”）。本文還介紹了折射的簡要歷史，以及這一概念如何成為實現高NA的限制因素。
 

顯微鏡物鏡

如果您細看顯微鏡上的物鏡，您會看到鏡筒處銘刻有多種不同的信息和數字。除了放大倍數和光學校正外，您還將看到另一組沒有單位的數字。這就是物鏡上的數值孔徑（或‘NA’）（見圖1）。

物鏡的NA是相對重要并且與圖像分辨率相關。簡單來說，分辨率是指物鏡區分樣本細節的能力。沒有對應的高NA，高放大倍數的物鏡也無法對樣本的細節加以分辨。

簡單來說，顯微鏡物鏡的NA就是透鏡在與所觀察物體的固定距離內收集光的能力。光穿過樣本時，會以倒錐形進入物鏡。但樣本中的部分光會出現折射（和反射），這樣反過來形成的圖像會具有較高的分辨率，并且比具有較低NA的物鏡包含更多的細節信息。
 

孔徑角

圖1：NA位于放大倍數后面（這里是：40x/0.6）
 

孔徑角

物鏡前透鏡收集到的光錐角的最大徑向角度又稱為‘孔徑角’（見圖1）。除了增加NA外，圖像亮度也與孔徑角成正比。孔徑角隨物鏡焦距而變化，它與物鏡前透鏡在樣本聚焦時捕獲的從樣本發出的成像光線的最大角度有關。

孔徑角與物鏡焦距成反比。隨著焦距的減小，物鏡前透鏡所能收集的光量也會增加。換言之，如果物鏡距離樣本很近，那么物鏡可以收集到更多的斜射光線。應該說，孔徑角通常由物鏡內的光學元件決定，每個物鏡都有一個最佳焦距。打個比方，想象一下：如果您站在一扇門前，門上有一個鑰匙孔可以看到另一個房間，那么當您在遠處時只能看到房間里的一點點光和極少的物品。如果您把眼睛湊近鑰匙孔，您將會看到房間里更多的細節和光線，因為理論上您增加了眼睛的孔徑角。

通過物鏡來收集并形成的圖像亮度和圖像細節（分辨率）與孔徑角有關。來自樣本的光會連續通過蓋玻片與物鏡前透鏡之間的空氣或者穿過浸沒介質。

圖2：孔徑角（A）是由前透鏡收集的

光錐的最大縱向角。α是光錐角的一半
 

NA的計算

數值孔徑可以用下列公式來表達和確定：
在以上公式中，‘n’為蓋玻片和物鏡前透鏡之間的介質折射率（例如空氣、水或油）。‘α’符號與光錐角的半角有關并且可通過透鏡進行收集（即孔徑角；見圖2）。

圖3：物鏡的焦距越短則孔徑角越寬，

從而獲得更高的NA和分辨率

空氣的折射率約為1.0，而水的折射率為1.3，用于光學顯微鏡的一些浸油的折射率可以高達1.52。
 

折射

要完全理解NA，先理解折射會比較有幫助。在光學和顯微鏡學當中，折射是指光波穿過樣本以及從樣本中傳來時改變了方向，這是由于光傳播經過的介質（例如空氣、玻璃、水或油）發生了改變。‘斯涅耳定律’中的公式就很好地對折射進行了描述。Willebrord Snellius（1580-1626）是荷蘭數學家和天文學家。他確定出計算地球半徑的新方法，還通過數學方法對折射進行了描述并因此名聲大噪。但他并不是第一個用數學方式描述折射現象的人，更準確地說，他只是“重新發現”了波斯數學物理學家Ibn Sahl 對于這種現象的描述。Ibn Sahl在984年的手稿中，就闡述了曲面透鏡和鏡子如何彎曲并聚焦光線。
 

斯涅耳定律中指出，入射光和折射光的角度之比等于光通過的折射率之比的倒數。

簡單地說，當光線從一種介質傳播到另一種介質時，它的速度會發生改變 – 例如當光從空氣傳播到水中時，光的速度會減慢。此外，當光以非90°的角度進入介質時，其速度的變化會導致方向改變。需要注意的是，光的頻率不會改變，但是波長將由介質的性質決定。

理論上，物鏡前透鏡收集的光錐的最大孔徑角為180°，α值為90°。由于90度的正弦值為1，因此能夠在空氣介質中從樣本上收集180°合成光的物鏡的理論NA值也為1。顯然，折射率是實現物鏡最高NA的限制因素。因此，高NA物鏡都會用浸泡介質代替空氣，如油或水。現實中，在樣本和物鏡前透鏡之間有空氣的情況下NA值不可能達到1，因此“干透鏡”（即非浸沒物鏡）的最高NA值接近0.95。這是因為大多數透鏡無法從樣本中收集180°的光，而最寬的角度約為144°。144°的正弦值為0.95而空氣的折射率為1.0，因此理論上最大值NA接近0.95。

高倍放大物鏡搭配較低的NA最終只能獲得較低的分辨率。很多顯微鏡企業在其物鏡當中盡可能將NA提高。所以如果您正在考慮為顯微鏡購買新的透鏡，那就要隨時考慮如何在自己的預算范圍內購買到NA最高的物鏡了。