多肽純化十問十答

  小編曾在本公眾號發布過一篇文章題為《大有講究的“小型蛋白”純化》，其后有諸多研究多肽藥物純化的讀者對這方面的分離純化頗感興趣，紛紛來電交流探討。小編特結合網絡資料和實踐整理出了多肽純化的十個問答題分享給大家，希望各位能夠喜歡。

1. 多肽含量與多肽純度有什么區別？
一條多肽產品中除了多肽本身還包括生產過程中帶入的水份及有機鹽分等雜質，多肽純度僅指多肽本身所含肽產品的含量及雜質的含量，不包括水份等雜質；而多肽含量則是指目標多肽在產品中的凈含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法來檢測；因此一條多肽即使純度達到99%，因為產品中還包含水份及有機鹽分等，它的含量可能也只有70-80%。

2 如何溶解多肽？多肽樣品在上制備柱前為什么需要進行前處理？有哪些前處理的方法？
多數多肽都可以用超純水溶解，對于一些難溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，對于酸性多肽，可先以小量堿性（如0.1%氨水）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對于堿性多肽，可先以小量酸性（如醋酸，三氟乙酸）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對于疏水性多肽，可用強極性有機溶劑溶解，如DMF，甲醇，丙醇，異丙醇，DMSO等。制備色譜柱子由于處理的樣品多，比分析柱子更容易受污染，因此有必要對樣品進行前處理以有效延長制備柱的壽命。主要方法有5種：萃取、過濾、離心、上預柱、加在線過濾器。

3. 為什么流動相中要加入三氟乙酸作為離子對試劑，還有哪些流動相體系或離子對試劑可用于多肽的分離純化？
目前常用的流動相體系是水加乙腈，以三氟乙酸（TFA）為離子對試劑，根據不同多肽以合適的梯度洗脫分離多肽。加入三氟乙酸能調節洗脫液的PH，同時作為離子對試劑與多肽相互作用，從而增強分離效果，明顯改善峰形。其它可用于多肽分離純化的流動相體系或離子對試劑包括醋酸體系，磷酸體系，鹽酸體系，七氟丁酸等通過適當的調節PH都能取得很好的分離效果。

4. 如何選擇純化過程中使用的色譜柱填料？
不同序列的多肽理化性質及疏水性有很大的區別，多數情況分子量小于4000和親水性多肽用C18柱分離效果最佳，分子量大于5000和極端疏水性的多肽以C4柱分離效果最佳，而C8柱介于C18和C4柱之間，其應用效果與C18柱更相似；對一些特殊選擇性的多肽，也可選擇苯基柱和聚合物色譜柱。

5. 在純化過程中選擇聚合物填料的原則是什么？
需要使用高于正常pH或溫度條件進行純化時，可以使用pH范圍極寬的聚合物色譜柱，它的優點就是在極端pH條件下不會降解，可以使用強酸和強堿作為流動相進行分離純化。

6. 影響多肽純度檢測結果的因素
影響多肽純度檢測結果的因素很多，主要包括：流動相體系、色譜柱型號、柱溫、波長及色譜儀的性能指標，每一項不同都可能造成結果產生誤差。

7. 在多肽檢測過程中經常出現基線漂移的原因是什么？怎么解決？
固定三氟乙酸濃度的梯度洗脫有時會在210-220nm檢測處造成吸收基線的漂移，這是許多反相分離中基線漂移的原因。降低或消除由于三氟乙酸光譜吸收變化引起的基線漂移需要盡量使檢測波長靠近215nm，并在溶劑B中比在溶劑A中少加15%的三氟乙酸補償基線漂移。例如溶劑A中的三氟乙酸為0.1%時，溶劑B中可用0.085%。

8. 反相色譜分離純化后，怎樣去除產品中流動相產品中的TFA，乙腈等雜質？
凍干的辦法應該可以除去大多數TFA和乙腈，只要不超過允許范圍，這種辦法是最簡單、有效的。對TFA含量要求更高的一些藥物肽凍干的方法一般無法完全達到要求，需要進行專門的轉鹽或脫鹽。 

9. 多肽一般有哪幾種鹽的形式？通過什么方式轉鹽或脫鹽？
多數多肽都是在TFA體系下分離純化的，所以多肽以TFA鹽的形式最多，其次藥物肽一般有醋酸鹽及鹽酸鹽的形式，極少數藥物肽會有一些特殊的鹽形式。轉鹽方式多為離子交換法和HPLC法，而脫鹽可用透析袋和超濾膜。

10. TFA在緩沖液中是不是只起到調節PH的作用？TFA的濃度越高基線漂移越厲害，那是不是說TFA的濃度在緩沖液PH允許的情況下越低越好？
（1）TFA起到類似離子對的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過高的濃度，會使溶液偏酸，長時間使用可能影響柱子壽命。
（2）同時TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時沖洗色譜柱。
（3）走梯度時，因為走成基線漂移，但對制備的影響不大。