Western Blot常見問題總結(jié)

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與或標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

關(guān)于Western Blot技術(shù)，我們實(shí)驗(yàn)室憑著幾年來的豐富經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出以下幾點(diǎn)建議：

1.抗體的選擇  

對(duì)于國內(nèi)的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來講，做western blot實(shí)驗(yàn)選擇抗體是個(gè)頭疼的問題。原因很簡(jiǎn)單，買進(jìn)口抗體捉襟見肘，買國產(chǎn)抗體得需要大無畏的勇氣。在我們實(shí)驗(yàn)室western blot實(shí)驗(yàn)歷程里，我們用過進(jìn)口抗體，進(jìn)口抗體國內(nèi)分裝包裝，國產(chǎn)抗體，質(zhì)量良莠不齊。 進(jìn)口抗體一般不會(huì)出現(xiàn)閃失：Abcam品種全，質(zhì)量過硬，但價(jià)高；Sigma的價(jià)最貴；比較有性價(jià)比的是CST的抗體，不足是CST的品種不多。Santa的多克隆抗體質(zhì)量可以，但是選用Santa的單抗還是有風(fēng)險(xiǎn)，估計(jì)這也是業(yè)界共識(shí)了吧。

進(jìn)口抗體國內(nèi)分裝包裝我們也用過不少，大概好抗體的比例約為50%，如果能做出來，也存在一個(gè)問題，就是抗體大多只能用一次國產(chǎn)抗體比較知名的就幾家，但質(zhì)量確實(shí)不敢恭維。Western blot能做出來的確實(shí)不多，而且雜帶多，背景不干凈。 

2. Western Blot實(shí)驗(yàn)條件 

具體的試劑配方我們是按寶生物試劑冊(cè)的附錄部分配制轉(zhuǎn)移電泳緩沖液可以回收再用兩次。轉(zhuǎn)膜我們是300毫安/2小時(shí)，轉(zhuǎn)膜一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。     

3.關(guān)于奶粉，膜的選擇 

奶粉看似簡(jiǎn)單，其實(shí)很重要，如果要湊合，可以到超市買脫脂奶粉。奶粉質(zhì)量不好，會(huì)最終導(dǎo)致顯影要么漆黑一片，要么啥都沒。我們現(xiàn)在用的BD的，很好很穩(wěn)定，可回收利用。 NC膜，PVDF膜我們都用過， PVDF膜的好處是蛋白載量大，韌性好。唯一的麻煩是事先得用甲醇泡幾分鐘，目的是為了增強(qiáng)膜的正電荷。甲醇泡完后，得在轉(zhuǎn)移緩沖液里泡一兩分鐘。

4 .關(guān)于顯色液

我們選用進(jìn)口超敏ECL顯色液。用普通的顯色液檢測(cè)內(nèi)參一般都沒問題，但對(duì)于表達(dá)量比較低的蛋白就不容易顯色出來，而超敏的就不一樣，即使蛋白表達(dá)量很低，也可以檢測(cè)出來。

5. Western Blot實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵 

Western Blot操作步驟多，每一步的失誤都會(huì)造成全盤失敗，綜合而言，抗體仍然是決定成敗的關(guān)鍵，如果抗體不好，就是神仙也沒招。其中內(nèi)參抗體很重要，因?yàn)閮?nèi)參抗體的選擇關(guān)系到全盤實(shí)驗(yàn)的考評(píng)。Actin，Tubulin，GAPDH我們都用過，Actin，Tubulin的缺點(diǎn)是有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)復(fù)帶，比較穩(wěn)定的還是GAPDH。如果用心看看cell，nature，science上的文章，大多用GAPDH做內(nèi)參。進(jìn)口的，國內(nèi)分裝的，國產(chǎn)的，我們都用過，效果都還可以。

從western實(shí)驗(yàn)我們總結(jié)出，實(shí)驗(yàn)上根本省不下來錢，一個(gè)環(huán)節(jié)的爛貨就會(huì)導(dǎo)致全盤失敗。對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而言，也是如此，一個(gè)步驟的疏忽會(huì)導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)立題和評(píng)估的邏輯混亂。如果要追求性價(jià)比，也就是如何發(fā)揮窮人的勞斯萊斯的最大收益，那從一開始就要按秋后算賬的原則選擇試劑，要算總賬；如果要讓實(shí)驗(yàn)順順利利，那就得注意每一個(gè)環(huán)節(jié)，步步為營，細(xì)節(jié)決定成敗。到現(xiàn)在，只要抗體work，幾乎沒有我們做不出來的分子，Western給了我們無窮的自信。

相關(guān)鏈接： 

• Western Blotting（蛋白質(zhì)印跡）技術(shù)
• 免疫共沉淀（CO-IP）
• 蛋白質(zhì)雙向電泳（2D）