采用快速、標準化的試劑盒方法對大鼠血漿中的英夫利昔單抗進行高靈敏度的定量分析
Mary Lame，Hua Yang, Sherri Naughton和Erin Chambers
沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)
關鍵詞
單克隆抗體，英夫利昔單抗，Remicade，蛋白定量，eXpress酶解
應用優勢
■ 簡單、標準化的蛋白定量方法。
■ 普遍適用的優化酶解套裝，為新藥研發省去了方法開發步驟。
■ 僅需4–6小時即可完成LC-MS分析的樣品前處理。
■ 分析英夫利昔單抗獲得了10 ng/mL的高靈敏度檢測限。
沃特世解決方案
ProteinWorksTM eXpress酶解套裝
完整單克隆抗體檢測標準品（部件號186006552）
ACQUITY UPLC® Peptide BEH C18,300Å 1.7 µm,2.1 mm × 150 mm肽分析專用柱（部件號186003687）
ACQUITY UPLC
Xevo® TQ-S質譜儀
ProteinWorks µElution SPE凈化試劑盒
簡介
隨著越來越多的藥物開發聚焦于抗體或ADC等大分子，研究傳統“小分子”的科學家面臨著挑戰，這種挑戰不僅來源于小分子研究復雜且耗時的特點，還來自于使用LC-MS進行蛋白定量時可能會涉及的多個工作流程。經常使用ELISA 和其它免疫親和(IA )方法研究蛋白質生物標志物的研究人員也面臨同樣的問題。雖然IA 方法非常靈敏且操作簡單，但其試劑重現性較差、缺乏標準化方法和交叉反應、線性動態范圍有限，還有其它一些缺點，由此推動了轉向LC-MS的方法開發，尤其是在發現研究和早期開發/臨床前研究領域。然而，LC-MS工作流程包含多個子部分，每個子部分又包含許多步驟。有關特定試劑以及每個步驟的時間、溫度和試劑濃度都可影響靈敏度，導致我們很難快速獲得能夠達到期望檢測限的方法。本應用紀要描述了使用ProteinWorks eXpress酶解套裝和方案快速、靈敏地對大鼠血漿中的英夫利昔單抗進行定量分析(圖 1 )的方法。采用一套通用的樣品前處理方法，使用經預先稱重且具有批次可溯源性的試劑，在一系列精心開發的通用型簡單分步操作說明的指導下分析英夫利昔單抗，可達到10 ng/mL的LLOQ (定量下限)。
實驗
樣品描述
首先使用蛋白A 瓊脂糖基96孔板對35 µL大鼠血漿中的英夫利昔單抗進行免疫純化。然后使用ProteinWorks eXpress 酶解套裝和方案處理樣品以用于LC-MS分析。最后使用ProteinWorks µElution SPE 凈化試劑盒和方案純化特征肽段。
圖1. 英夫利昔單抗(Remicade)E的蛋白質結構。
LC條件
LC系統：ACQUITY UPLC
檢測：Xevo TQ-S質譜儀，ESI+
色譜柱：ACQUITY UPLC® Peptide BEH C18,300Å 1.7 µm,2.1 mm × 150 mm肽分析專用柱
柱溫：55 ℃
樣品溫度：10 ℃
進樣體積：10 µL
流動相A：0.1%甲酸水溶液
流動相B：0.1%甲酸的乙腈溶液
梯度
MS條件
毛細管電壓(kV)：3
錐孔電壓(V)：30
電離源補償(V)：50
離子源溫度(℃)：150
脫溶劑氣溫度(℃)：600
錐孔氣流速(L/h)：150
碰撞氣體流速(mL/min)：0.15
噴霧器氣流(Bar)：7
數據管理
MassLynx® (4.1版)
結果與討論
隨著英夫利昔單抗的美國專利有效截止期限2017年越來越近1，CRO(合同研究機構)和生物仿制藥研究實驗室對這種重要藥物的關注度也日益增加。然而，典型的工作流極其復雜，而且有多種選擇和選項。這使得開發高靈敏度方法充滿了挑戰。在本應用紀要中，我們使用ProteinWorks eXpress酶解套裝來簡化和精簡流程。使用SPE方法，在總共不到6小時的時間內就完成了英夫利昔單抗樣品的親和純化、酶解和肽段提取。該方法讓我們在同一天即可開始采集數據，到第二天早上仍有多個96孔板正在運行。我們同時監控了多種獨特的特征肽段和一種通用人類肽段用于定量。使用來自重鏈的特征肽SINSATHYAESVK 時獲得了最佳靈敏度，英夫利昔單抗的其它特征肽段(DILLTQSPAILSVSPGER，輕鏈)及通用肽段(DSTYSLSSTLTLSK，輕鏈)的監控數據被用于結果確證。將來自普通小鼠mAb標準品(部件號186006552)的特征肽段(SVSELPIMHQDWLNGK)作為內標。
使用試劑盒提供的優化的方案和試劑，僅需35 µL血漿就能在英夫利昔單抗分析中達到10 ng/mL的檢測限(圖2)。表2匯總了各個肽段的標準曲線的線性和準確度。主要定量肽段SINSATHYAESVK 的靈敏度最高，在超過4個數量級的范圍內均保持線性，且標準曲線上所有點的平均準確度大于98% 。另外兩個肽段在超過3.5個數量級的范圍內保持線性，且標準曲線上所有點的平均準確度大于99% 。
圖2. 大鼠血漿樣品的色譜圖，圖中顯示了濃度為10 ng/mL的英夫利昔單抗(與空白大鼠血漿樣品相比)。使用特征肽段SINSATHYAESVK 對英夫利昔單抗進行定量。
表2. 用于定量大鼠血漿中英夫利昔單抗的特征肽段的線性動態范圍和標準曲線統計數據。
此外，QC 樣品的準確度和精度非常出色，所有變異系數(%CV)均小于6%。相關數據匯總于表3中。事實上，SINSATHYAESVK 肽段的QC 樣品的平均變異系數小于3%。
表3. 用于定量的所有英夫利昔單抗肽段QC 樣品的統計數據。
通過色譜數據評估可以明顯看出，峰寬和殘留內源性組分分離方面的數據質量提升幫助我們實現了低濃度水平的檢測并獲得了極高的準確度和精度。圖3-5中所有特征肽段的QC 色譜圖都可以得出該結論(并且圖中已突出顯示)。
圖3. 英夫利昔單抗獨有的特征肽段SINSATHY AESVK的QC色譜圖。
圖4. 英夫利昔單抗獨有的特征肽段DILLTQSPAILSVSPGER的QC 色譜圖。
圖5. 英夫利昔單抗的通用特征肽段DSTYSLSSTLTLSK 的QC色譜圖。
結論
我們應用ProteinWorks eXpress酶解套裝，利用一系列典型的標準曲線和大鼠血漿QC 樣品成功地對英夫利昔單抗進行了純化。在保持出色線性和個位數精確度的同時，輕松達到了10 ng/mL的定量限。包含親和純化步驟在內的總樣品前處理時間不超過6小時。總的酶解準備時間僅2小時。基于試劑盒的通用方法讓初學者能夠通過簡單的分步方案和一系列標準化、經預先檢測的試劑獲得超低的檢測限，還可確保實現所需的靈敏度，同時保證了此類方法能夠靈活轉換。
參考文獻
1. McKinsey and Company; Data Source: Evaluate Pharma, US Patent Expiration Dates.
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