使用高靈敏度方法建立人體血漿中2.5 pg/mL濃度的氯吡格雷定量方法

使用 Xevo TQD、ACQUITY UPLC H-Class 系統(tǒng)和UNIFI 科學信息系統(tǒng)建立人體血漿中2.5 pg/mL濃度的氯吡格雷定量方法

Jennifer L. Simeone 和 Paul D. Rainville
沃特世公司（美國馬薩諸塞州米爾福德市）

應用優(yōu)勢
使用高靈敏度方法完成了人體血漿中氯吡格雷的分析。

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC®H-Class系統(tǒng)
Xevo®TQD質譜儀
Oasis®MCX µElution固相萃取（SPE）板
UNIFI® 科學信息系統(tǒng)

關鍵詞
氯吡格雷、動脈粥樣硬化、硫醇代謝物、石炭酸代謝物、血漿

簡介

氯吡格雷是一種噻吩并吡啶衍生物——抗血小板的前體藥物，可以預防動脈粥樣硬化。口服后，服用的化合物經(jīng)肝代謝生成活性硫醇代謝物和非活性羧酸代謝物。人體中與循環(huán)氯吡格雷相關的物質大多是非活性代謝物，而活性代謝物和未發(fā)生變化的前體藥物含量非常低。反應的機制源自活性硫醇代謝物與細胞受體P2Y12的結合，從而不可逆轉地抑制血小板的活化過程。¹

由于活性硫醇代謝物存在的反應性以及未發(fā)生變化的前體藥物濃度偏低，大部分定量研究都建立在非活性代謝物的循環(huán)水平上。本應用紀要描述了一種新開發(fā)的高靈敏度固相萃取和LC/MS/MS分析方法，可以對人體血漿中的前體藥物氯吡格雷進行分析。

實驗

樣品描述
樣品通過Oasis MCX µElution固相萃取（SPE）板進行制備。將350 µL的血漿樣品與20 µL內標物（氘代氯吡格雷）溶液和350 µL的含水緩沖溶液混合。使用甲醇和含水緩沖溶液對固相萃取板進行預平衡。將樣品加到固相萃取板，使用水 - 甲醇溶液沖洗，并用2×25 µL含5%NH4OH的IPA/ ACN（60:40）溶液洗脫，用25 µL水稀釋后進樣。分析采用ACQUITY UPLC H-Class色譜系統(tǒng)，進樣10 µL。用ACQUITY UPLC C₁₈ 2.1 × 50 mm，1.7 µm色譜柱進行分離，分析時間為 3 min，流速為600 µL/min。 使用Xevo TQD質譜正離子模式檢測，其中氯吡格雷MRM為322 → 212，d4內標物MRM為326 → 216。

結果和討論
如圖2所示，氯吡格雷的保留時間為2.10 min，其色譜峰非常對稱，基線峰寬僅為3s，有利于色譜峰的處理和峰積分。分析時間僅需3min，因此每天至少可以分析兩個SPE板。圖2中所示為500 pg/mL標準品的分析后的的血漿空白樣品的結果。數(shù)據(jù)表明ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)的殘留非常低，從而使Xevo TQD質譜儀的檢測靈敏度能夠得到充分的體現(xiàn)。

本分析方法的定量下限（LLOQ）為2.5 pg/mL。連續(xù)三天采用獨立的96孔板進行批量分析，對分析方法進行方法學驗證，線性濃度范圍為2.5到500.0 pg/mL，分析典型標準曲線如圖3所示，相關系數(shù)介于0.9988到0.9995之間（1/x）。日內的精密度和準確度驗證數(shù)據(jù)列于表1、2和3中。數(shù)據(jù)表明：對于2.5pg/mL的LLOQ，變異系數(shù)的范圍為5.8%到12.2%，偏差范圍為-6.9%到-13.6%。對于高濃度QC（300 pg/mL），變異系數(shù)的范圍為1.2%到2.9%，偏差范圍為1.4%到1.6%。日間的精密度和準確度數(shù)據(jù)列于表4。對于2.5  pg/mL的LLOQ，變異系數(shù)為8.5%，偏差為-9.4%。對于高濃度QC（300 pg/mL），變異系數(shù)為2.3%，偏差為 1.5%。

結論
  ■ 本實驗開發(fā)了一種高靈敏度分析方法，可以用于分析人體血漿中的氯吡格雷。
  ■ 在3天的方法學驗證實驗中，日內和日間的精密度和準確度均非常好。
  ■ 定量限確定為2.5  pg/mL，變異系數(shù)和偏差都遠遠低于 +/- 20% 的標準。
  ■ 該方法殘留小，完成高濃度的標準品分析后，萃取的空白樣品中殘留濃度遠低于LLOQ的20%。

參考文獻
1.   Pereillo JM, Maftouh M, Andrieu A, Uzabiaga MF, Fedeli O, Savi P, Pascal M, Herbert JM, Maffrand JP, Picard C. Structure and stereoc hemistry of  the active metabolite of  clopidogrel.Drug Metabolism and Disposition. 2002;  30: 1288-1295