瘦肉精檢測高效液相色譜法（鹽酸克倫特羅檢測方法）
一、如何檢測瘦肉精？
目前，檢測瘦肉精的方法主要有四種，即高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)、毛細管區帶電泳法(CE)和免疫分析技術(IA)。而我國結合自己的實際情況，2001年農業部首先組織制定了飼料中鹽酸克倫特羅的測定標淮。該標準選擇確定了兩種：即高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)。其中將HPLC法作為檢測瘦肉精的半確證性方法，其最低檢測限為0.05μg/ kg，優點是檢測精確度高，而且假陽性率低；缺點是檢測過程煩瑣、檢測時間長，需貴重儀器、難于操作、價格昂貴。而GC-MS法優點是能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析。GC-MS法與HPLC法相比，檢測靈敏度更高，假陽性率更低，已將GC-MS法定為檢測瘦肉精的確證性方法。GC-MS法的缺點同HPLC相似。
目前，英國的Randox Laboratories litd和德國的R-biopharm公司均開發出了檢測肉品、飼料中瘦肉精的ELISA試劑盒。
二、瘦肉精檢測所需試劑和試紙
(1)試劑和材料 以下所有試劑，除特別注明外，均為分析純試劑；水為符合GB／T6682規定的二級水。
①鹽酸克倫特羅對照品：含鹽酸克倫特羅不得少于98．5％
②鹽酸
③無水甲醇
④氫氧化鈉
⑤磷酸二氫鉀
⑥磷酸
⑦鹽酸溶液 取鹽酸4．2ml，加水至1000ml，即得。
⑧o．5mol／L磷酸二氫鉀溶液 取磷酸二氫鉀68g，加水800ml溶解并用磷酸調pH值至3．O，用水稀釋至1000ml，即得。
⑨0．05mol幾磷酸二氫鉀溶液 取磷酸二氫鉀6．88，加水800ml溶解并用磷酸調pH值至3．0，用水稀釋至1000mi，即得。
a．氫氧化鈉溶液 取氫氧化鈉48，加水使溶解成100mi，即得。
b．鹽酸克倫特羅對照品儲備液(1mg／mi) 準確稱取28．3mg鹽酸克倫特羅對照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。
⑩鹽酸克倫特羅對照品工作液(10ttg／mi) 取lmg／mi儲備液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1個月。
⑾鹽酸克倫特羅對照溶液(100ng／m1) 取1(ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1個月。
⑿鹽酸克倫特羅檢測試劑盒(2～8~C冰箱中保存)
⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％
(2)儀器和設備
STI500高效液相色譜儀
VI2010智能色譜軟件
UV501可變光紫外檢測器
安捷倫1100二極管陣列檢測器
8725i手動進樣閥、VI-11手動進樣閥
VertexC18 4.6*250,5um高性能液相色譜柱
①酶聯免疫反應讀數儀
②分析天平 精度0．00001g
③天平 精度0．01g
④冷凍離心機
⑤50mi具塞離心管
⑥勻漿機
⑦微型振蕩器
⑧回旋振蕩器
⑨微量移液器 單道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL，
⑩干熱濃縮器
①空氣壓縮機
(3)測定步驟
①試料的制備(尿)
取供試尿lml，于3000r／min離心l0min，上清液作為供試試料，直接供酶聯免疫測定法測定。
取空白尿lml，于3000r／min離心l0min，上清液作為空白試料，直接供酶聯免疫測定法測定。
取空白尿2ml，于3000r／min離心l0min，上清液1.0ml添加l00ug／L的克倫特羅對照溶液20／H。作為2ug/l空白添加試料，直接供酶聯免疫測定法測定。
②試料的制備(肝)
取約l00g新鮮或冷凍后融化的空白或供試豬肝,用勻漿機以10000r／rain勻漿1-2min，使均勻呈糊狀，一20~C以下冰箱中貯存備用。
取均漿后的供試肝樣，作為供試試料。
取均漿后的空白肝樣，作為空白試料。
取均漿后的空白肝樣(1土0．05)e添加l00ng／m1的克倫特羅對照溶液20tzL作為2ng／g空白添加試料。
a：提取(肝) 取(1士o．05)z試料，置50ml離心管中；加鹽酸溶液5.0mi，旋渦混勻，中速振蕩1．5h；在10—15~C下以4000r／mill以上速度離心15min；上清液移人另一50ml離心管中，加入氫氧化鈉溶液300gL，混勻，振蕩15min；加0.5mol／l磷酸二氫鉀溶液4。0ml，混勻，2—8~C放置過夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度離心15min，上清液備用。
b．凈化(肝) C，，固相萃取柱依次用無水甲醇3mi、0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液2mi預洗，不使柱床干涸；將備用上清液全部過柱；用0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液2ml淋洗，擠干，棄去所有淋洗液；用無水甲醇2mi洗脫，流速控制在0.5ml／mm以下，擠干，收集洗脫液；于50～60~C下用氮氣或空氣緩緩吹干洗脫液；殘余物用水1.0ml溶解，以4000r／mill以上的速度離心15rain，清液作為試樣溶液供酶聯免疫測定法測定。
③測定
a．室溫應控制在19～30~C。
b．取在19—30~C放置1—2h的試劑盒，按每個標準溶液和試樣溶液至少兩孔計算所需酶聯板條的數量，插入框架。每個微孔加入用緩沖溶液100倍稀釋的抗體100~tL，封口膜封板，室溫孵育30min。
c倒出孔內液體，將酶聯板倒置在吸水紙上拍打，使孔內沒有殘余液體。用多道移液器加水250pL到酶聯板的微?L內，稍后倒出孔內液體，再將酶聯板倒置在吸水紙上拍打，如此重復操作洗板3次。
d．分別吸取標準溶液、空白試料、空白添加試料和供試試料各20uL，分別放入不同微孔底中央，并在每孔內加入用緩沖溶液100倍稀釋的酶結合物100~I。，在微型振蕩器上混勻，用封口膜封好，室溫孵育30min。
e．倒出孔內液體，將酶聯板倒置在吸水紙上拍打，使孔內沒有殘余液體，重復洗板3次。
f．用多道移液器加入用底物緩沖溶液10倍稀釋的底物100uL，室溫避光孵育15min。
g．用多道移液器每孔加終止液100uL。
h．在1h內將酶聯板放于酶標儀內，于450nm波長處測定吸光度值。
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(4)計算 用數據分析軟件對結果進行分析，繪出標準曲線，并得出試料中克倫特羅的含量。
(5)靈敏度和回收率
本方法的平均檢測下限為0.1mg／Kg。
本方法在1ug／kg添加濃度水平上豬尿回收率范圍為60％一120％，豬肝回收率范圍為40％～120％。
