牛體內重組牛生長激素 (rbST) 快速高靈敏度檢測

牛體內重組牛生長激素 (rbST) 快速高靈敏度檢測

Gaud Pinel1 ， Sandrine Roulet-Rochereau1 ， Marie-Hélène Le Breton1,2 ，
Sylvain Chéreau1 ， Fabrice Monteau1 ， Paul Silcock3 ，與 Bruno Le Bizec1
1 Laboratoire d’ Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA) ， ONIRIS ， Nantes ， France 法國 LABERCA 化學實驗室
2 瑞士洛桑雀巢公司，雀巢研究中心
3 英國曼徹斯特沃特世公司

應用優勢

牛注射了重組牛生長激素，過幾天后檢測藥物在牛體內的殘留。首次得到了明確的檢測結果，可用于此類藥物的使用監控。

■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準確檢測生物基質中的重組牛生長激素（ rbST ），符合 2002/657/EC 要求。
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測動物血液中痕量的殘留激素藥物。
■ Xevo TQ MS 提供重復性好的結果，且基質效應很低，這對于藥物監控計劃實施中的常規分析來說是十分重要的。

沃特世解決方案

■ ACQUITY UPLC ， Xevo TQ MS

關鍵詞

■ rbST ， reST ，生長激素，食品安全

簡介

動物性食品安全控制是政府、國際法規機構與組織的重要任務，應該在食品進入消費環節之前就對食品安全進行有效的檢測和控制。因為上市后的食品安全事件可能影響消費者信心與國際貿易。

重組牛生長激素（ rbST ），又稱為生長激素，在一些國家通常作為豬或牛的生長促進劑，將其用于乳牛可以增加牛奶產量 1,2 。然而，生長激素的使用有嚴格的法律規范，在歐盟國家是完全禁用的 3,4 。但是，這項法規的執行面臨著很大的困難，主要是因為缺乏有效的分析工具來檢測是否存在濫用該激素的情況。此分析的困難在于生長激素本身是蛋白質，且在生物基質中濃度較低，而樣品基質組成又十分復雜。至今為止，分析方法僅僅局限為酶聯免疫檢測，這個方法不能將天然存在的激素與重組激素分離開來；盡管也有其它應用報導，但都不能專屬性很強地檢測生理水平的重組牛生長激素（ rbST ） 5,6 。

直到最近才開發出了一項直接檢測生物基質中重組牛生長激素（ rbST ）的方法 7,8 ，這個方法是將重組生長激素用胰蛋白酶進行水解，然后分析生長激素專有的 N- 端肽鏈。事實上，天然激素的 N- 端氨基酸是丙氨酸，而重組激素的 N- 端氨基酸是甲硫氨酸。

此應用文章展示了使用 Waters® XevoTM TQ MS 分析注射了重組激素的動物血漿樣品中的藥物。在注射后幾天進行檢測，可清晰檢測出結果，展示了一流水平。

實驗部分

重組激素標準品

重組牛生長激素（ rbST ）標準品與重組馬生長激素（ reST ）分別購自哈勃 UCLA 醫學中心國家激素與垂體項目（美國托蘭斯）以及 Bresagen 有限公司（澳大利亞 T hebarton ）。

樣本制備

重組牛生長激素在血漿中的樣本提取、純化步驟依照文獻進行。 7,8

MS 條件

MS 系統： XEVO TQ MS
離子化模式： ESI+
毛細管電壓： 3 kV
源溫度： 150 ℃
脫溶劑溫度： 550 ℃
脫溶劑氣速： 800 L / 小時
碰撞氣流速： 0.15 mL/ 分

MRM 方法參數

MRM 通道通過 Masslynx 軟件中的 IntelliStartTM 行獨立的參數優化，詳見表 2 。

結果與討論

LC/MS/MS 條件優化

ACQUITY UPLC 系統對胰蛋白酶水解的 N- 端肽片段又很好的保留和分離效果，總運行時間 8 分鐘，重組牛生長激素（ rbST ）與重組馬生長激素（ reST ）的 N- 端保留時間分別為 2.74 和 2.79 分鐘（圖 1 ）。

重組牛生長激素（ rbST ） N- 端肽鏈在電噴霧正離子模式產生雙電荷的離子 [M+2H]2+=913 ，將此離子作為母離子。根據 2002/657/EC 歐盟委員會決議 10 ， MRM 方法中選擇了兩個子離子用于確證；重組馬生長激素（ reST ）作內標物，在樣品中的濃度為 100 ng/mL ，其 N- 端肽鏈在電噴霧正離子模式產生三價電荷的離子 [M+3H]3+= 623 ，將其作為母離子。

動物注射生長激素后體內 rbST 的檢測

此方法用于檢測注射生長激素后的動物樣品。對奶牛一次性皮下注射 500mg Lactatropin® 藥物，然后取樣分析。

圖 1 對 10 ng/mL 的 rbST 和 reST 標準品進樣， UPLC(ESI+)/MS/MS 的 MRM 特征離子信號分別為 rbST 的 N- 端碎片離子為 913>774 和 913>1047 ； reST 的 N- 端碎片離子為 623 >795 和 623 >530

圖 2 使用 UPLC （ ESI+ ） /MS/MS 分析注射藥物前（ D0 ）與注射后兩天（ D2 ）采集到的血漿樣本的的 MRM 特征離子信號圖譜

圖 2 顯示了注射藥物前采集到的血漿樣本得到的譜圖（ D0 ）以及注射藥物兩天后血漿樣本的譜圖（ D2 ）。

圖 2 的結果表明：可以在給動物注射生長激素兩天后在奶牛的血漿中檢測到 rbST 。對采集到的特征信號分析表明此方法可以對生長激素這個蛋白進行明確的確證，符合 2002/657/EC 的要求，同時確認了檢測方法的靈敏度。

與預計的動物血漿蛋白水平一致。基質干擾幾乎檢測不到，在實際血漿樣本中的良好線性可保證對 rbST 的進一步相對定量結果，在注射生長激素兩天后還可以檢測到血漿中 50 ppb 的藥物，與以往實驗結果一致 7,11 。表 3 顯示了平行進樣 10 次得到的分析結果，這充分說明 Xevo TQ MS 在檢測低含量復雜樣品時能夠提供重復性好的數據。

結論

■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準確檢測生物基質中的重組牛生長激素（ rbST ），符合 2002/657/EC 要求
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測動物血液中痕量的殘留激素藥物
■ Xevo TQ MS 提供重復性好的結果，且基質效應很低，這對于藥物監控計劃實施中的常規分析來說是十分重要的

參考文獻

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