Oasis HLB 凈化和 aCQUiTY UPLC/TQD 快速分析動物性食品中糖皮質類激素興奮劑的含量

李建中，金琦蕓， Yap Swee Lee 沃特世公司，上海，中國

概要

本文應用沃特世 (Waters®)Oasis® HLB 固相提取技術和 ACQUITY UPLC® 超高效液相色譜 /TQD 串聯四極桿質譜系統測定分析動物性食品中糖皮質類激素興奮劑。

前言

糖皮質激素 (Glucocorticoids ) 的化學結構屬于類固醇類化合物，具有調節糖代謝，促進蛋白轉化為糖，提升血糖濃度，抗炎癥、抗過敏作用，調節水鹽代謝等作用。從體外大量攝入糖皮質類激素會造成體內激素比例失調，糖代謝和無機鹽代謝紊亂；長期大量使用糖皮質類激素還會誘發或加重感染，出現心血管系統并發癥、骨質疏松、肌肉萎縮、傷口愈合遲緩以及出現消化系統并發癥，例如使胃酸、胃蛋白酶分泌增加，抑制胃粘液分泌，降低胃腸粘膜的抵抗力，甚至造成消化道出血或穿孔。糖皮質類激素對人體健康除了具有很多副作用外，也會影響運動員參加比賽時的身體狀態，違背了體育比賽公平競爭的原則，所以此類藥物屬于國際奧委會宣布禁用合成類固醇類興奮劑。近年來在一些供運動動員食用的保健類食品、營養補充劑及部分動物性食品中檢出含有糖皮質類激素類的事件屢有發生，由于誤食此類被污染的食品，使很多運動員出現不必要的陽性結果。 2008 年北京奧運會除對參賽運動員進行嚴格的興奮劑檢測外，同樣要對供運動員食用的各類食品進行嚴格的監測。本文采用沃特世 HLB 固相提取凈化技術和 UPLC®/TQD 系統建立動物性食品中糖皮質類激素的快速、高通量篩查及確證技術，為此類食品的興奮劑監測提供了全方案的技術支持。

實驗方法

試劑和材料

20 孔真空提取裝置，旋轉蒸發儀， Oasis HLB(500 mg ， 6 cc ) ；乙腈，甲醇，甲酸，乙酸乙酯均為色譜純，實驗用水為超純水，無水硫酸鈉。糖皮質類激素標準品：潑尼松，潑尼松龍，氫化可的松，可的松，甲基潑尼松，倍他米松，地塞米松，倍氯米松，氟氫可的松，純度 ≥98% 。

液相色譜條件

液相系統： 沃特世 ACQUITY UPLC
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C18
2.1mm x 50mm ， 1.7 μm
柱溫： 30˚C
流速： 500 μL/min
流動相 A ： 水
流動相 B ： 乙腈
梯度： 時間 0 min 20% B
時間 5 min 25% B
時間 5.3 min 50% B
時間 5.5 min 60% B
時間 5.6 min 20% B
時間 6.5 min 20% B
總分析時間 6.5 min 進樣量： 10 μL

質譜條件

質譜系統： 沃特世 ACQUITY® TQD 檢測器
電離模式： ESI(-)
毛細管電壓： 2.8 kV
去溶劑氣溫度： 400˚C
去溶劑流速： 800 L /h
離子源溫度： 130˚C
數據采集： 多反應監測 (MRM)
碰撞氣體： 氬氣 3.2 x 10-3 mba
調節 ACQUITY TQD 使得母離子和子離子在半峰寬的分辨率為 0.7 Da 以內。本實驗的多反應監測 (MRM ) 、駐留時間、錐孔電壓和碰撞能量列表參見表 1 。標注下劃線的離子對用于定量分析。

數據采集和處理方法

沃特世公司 MassLynx™4.1 操作軟件用于數據采集， TargetLynx™ 應用管理軟件用于數據處理。

樣品前處理

稱取 5 g 的處理均勻的豬肉樣品，依次加入 10 g 無水硫酸鈉， 20 mL 乙酸乙酯，混合均勻后均質 1 min ，振蕩提取 10 min ，在 10000 轉 /min 下離心 5 min 。上清液轉移至濃縮瓶中，再向殘渣中加入 10 mL 乙酸乙酯重復上述操作一次，合并兩次提取液，在 40 ˚C 下旋轉蒸發至干。濃縮后樣品用 5 mL 30% 甲醇水溶液溶解。 Oasis HLB 預先依次用 3 mL 甲醇， 6 mL 水活化。將上述提取液全部通過柱，依次用 5 mL 水， 5 mL 50% 甲醇水溶液淋洗后抽干。用 10 mL 甲醇 / 乙腈 (1:1 ) 洗脫并接收，洗脫液在 40˚C 下氮氣吹干后，用乙腈 / 水（ 2:8 ）溶解定容至 1 mL ，過 0.2 μm 濾膜后上機分析測定。

結果與討論

樣品前處理條件的確定

糖皮質類激素屬于一類脂溶性激素，在結構上都是環戊烷多氫菲衍生物。所以選擇采用乙酸乙酯作為提取溶劑能夠實現從動物組織中有效的提取此類藥物。由于此類化合物具有較強的非極性，在 HLB 柱上有較強的非極性保留作用，所以實驗采用低洗脫強度的甲醇 / 水溶解樣品提取物轉移上 HLB 柱，依次用水和 50% 甲醇水溶液洗除極性、中等極性的樣品基質雜質，再用甲醇 / 乙腈混合溶劑把糖皮質類激素藥物洗脫下來，而部分動物油脂等非極性雜質保留在 HLB 上，從而實現了糖皮質類激素的有效凈化富集。

表 1. ACQUITY TQD MRM 參數。

色譜條件的優化

由于 9 種糖皮質類激素化合物極性上存在一定差異，所以采用梯度方法在乙腈 / 水的流動相體系下實現分離，結果見圖 1 。其中潑尼松龍和可的松 (405.2 ﹥ 329.2 ， 405.2 ﹥ 359.2 ) ，倍他米松和地塞米松 (437.2 ﹥ 361.2 ， 437.2 ﹥ 391.2 ) 兩組化合物的母離子和子離子完全一樣，只是在結構上空間異構，在質譜上無法區分，所以必須通過色譜實現分離后定量定性分析，實驗優化了梯度程序、色譜柱溫及流速，使兩組化合物實現了基線分離，從而能夠準確定性和定量測定。

質譜條件的優化

在 ESI(-) 模式下，糖皮質類激素化合物形成 [M-H+HCOOH]- 形式的分子離子峰，通過碰撞處理，子離子掃描進一步得到定量和輔助定性子離子碎片峰，進而采用 MRM 模式進行監測， MRM 條件參見表 1 。實驗分別對毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數進行了優化，使方法靈敏度和分辨率滿足檢測需要。

方法的線性范圍、準確度和精密度

9 種糖皮質類激素混合標準品在 1 ng/mL ~ 100 ng/mL 濃度范圍內進樣分析，得到線性方程和相關系數。采用空白樣品添加 10μg/kg 水平下，平行 6 次，計算添加回收率及 RSD ， 結果參見表 2 和圖 2 。

圖 2. 糖皮質類激素標準品、空白樣品、添加樣品總離子流 (TIC ) 色譜圖。

表 2. 糖皮質類興奮劑測定方法線性方程、相關系數、相對標準偏差和回收率。

結論

本文采用 HLB 凈化和 UPLC/TQD 系統建立了快速有效的監測動物性食品中 9 種糖皮質類激素的全分析方案。 Oasis HLB 能夠有效地對動物性樣品進行凈化和富集，除去油脂、蛋白等基質干擾，提高了方法靈敏度，降低了基質效應； UPLC/TQD 系統在 6.5 min 內實現了高效分離和快速測定，同時實現了準確定量和確證的目的。為奧運動物性食品中糖皮質類激素的監測提供了有力的技術支持和參考，也對其它類型食品的監測提供有意義的借鑒

參考文獻

•  Vaerie A.Frerichs,Kathleen M.Tornatore. Journal of ChromatographyB,802(2004) 329-338.
•  Van den hauwe,F.Dumoulin,J.P.Antignac,M.P.Bouche,C.Elliott,C.Van Peteghem. Analytica Chimica Acta,473(2002)127-134.
•  Olivia Van den hauwe,Manuela Schneider,Ali Sahin,Carlos H.Van Peteghem. J.Agric. Food Chem,51(2003)326-330.