漢莎快訊（三）:葉綠素熒光—光合作用研究和光能分配的探針
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葉綠素熒光—光合作用研究和光能分配的探針（基礎(chǔ)理論篇）
Kautsky和Hirsh（1931）最先認識到光合原初反應(yīng)和葉綠素熒光存在著密切關(guān)系。他們第一次報告了經(jīng)過暗適應(yīng)的光合材料照光后，葉綠素熒光先迅速上升到一個最大值，然后逐漸下降，最后達到一個穩(wěn)定值。此后，隨著研究的深入，人們逐步認識到熒光誘導動力學曲線中蘊藏著豐富的信息。
No investigation into the photosynthetic performance of plants under field conditions seems complete without some fluorescence data. ------- Giles N.Johnson
葉綠素熒光動力學包含著光合作用過程的重要信息，如光能的吸收和轉(zhuǎn)化。能量的傳遞與分配、反應(yīng)中心的狀態(tài)，過剩能量的耗散以及反映光合作用的光抑制和光破壞。應(yīng)用葉綠素熒光可以對植物材料進行原位、無損傷的檢測，且操作步驟簡單。所以葉綠素熒光越來越受到人們的青睞，在光合生理和逆境生理等研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
葉綠素熒光產(chǎn)生的基本原理：
葉綠素分子吸收光能（激發(fā)能）后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定的狀態(tài)，就會再回到基態(tài)，電子由基態(tài)回到基態(tài)的過程中，大部分能量轉(zhuǎn)向反應(yīng)中心推動光化學反應(yīng)及后來的電子傳遞光合磷酸化，固定。還原CO2最終將能量貯存在有機物中，一小部分能量以熱的形式耗散，再有一部分能量以熒光的形式發(fā)出。這三者之間是此消彼長相互競爭的關(guān)系。因此我們可以用葉綠素熒光來研究光合作用的變化。
植物體內(nèi)的葉綠素熒光誘導動力學曲線的測定可采用脈沖調(diào)制式熒光儀和連續(xù)激發(fā)式（非調(diào)制式）熒光儀兩種不同的方法，它們各有不同的特點。
脈沖調(diào)制式熒光儀：
由于調(diào)制式熒光儀用來測量熒光的光源是調(diào)制脈沖光（高頻率的閃光），植物發(fā)出的熒光信號與儀器光源發(fā)出的光可以區(qū)分開，所以用它可以在有背景光的情況下測定。常用的做法是，調(diào)制式熒光儀的測量步驟是，先打開測量光（measuring light），測暗適應(yīng)葉片的最小熒光（FO），然后打開飽和脈沖光（saturating flash light）測暗適應(yīng)葉片的最大熒光（FM），然后再開啟作用光（actinic light）使所測材料受光而進行光合作用。當所測材料光適應(yīng)后，開啟測量光測光適應(yīng)葉片的穩(wěn)態(tài)熒光（FS），然后打開飽和脈沖光測光適應(yīng)后的最大熒光（FM’），關(guān)掉作用光，打開遠紅光（far-red light）優(yōu)先激發(fā)PSⅠ使PSⅡ電子傳遞體處于氧化狀態(tài)，測定光適應(yīng)葉片的最小熒光（FO’）（圖2）。根據(jù)這些變數(shù)可以計算暗適應(yīng)下PSⅡ的最大量子產(chǎn)額[FV/FM=(FM-FO)/FM]、光適應(yīng)下PSⅡ的最大量子產(chǎn)額[FV’/FM’= (FM’-FO’)/FM’]、光適應(yīng)下的PSⅡ反應(yīng)中心開放的比例[qP=(FM’-FS)/( FM’-FO’)]、光適應(yīng)下PSⅡ的實際光化學效率[ΦPSII=(FM’-FS)/FM’]（Genty等 1989）、光適應(yīng)下的非光化學猝滅[NPQ=FM/FM’-1]（Demmig-Adams和Adams 1996）等。這些參數(shù)除了FV/FM反映了熒光誘導動力學曲線上升過程的O-P段外，其它都是反映P點之后的下降過程。由于光合作用的碳同化反應(yīng)能反饋影響光合原初反應(yīng)，調(diào)制式熒光儀主要通過測量光合作用的原初光化學反應(yīng)的情況來反映光合作用的碳同化等反映啟動后的光能捕獲、轉(zhuǎn)化及利用情況。而對于碳同化反應(yīng)活化前PSⅡ的光化學變化，所獲得的信息就很少了。由于時間分辨率及信噪比的限制，對于從O-P上升過程中熒光變化的信息量的獲得，與連續(xù)激發(fā)式熒光儀相比，調(diào)制式熒光儀遠不及前者。
連續(xù)激發(fā)式熒光儀：
連續(xù)激發(fā)式熒光儀（PEA或Handy PEA，Hansatech，英國）主要是通過短時間照光后熒光信號的瞬時變化反映暗反應(yīng)活化前PSⅡ的光化學變化，它具有相當高的分辨率（初始記錄速度為每秒鐘10萬次，即100kHz），所以能夠從O-P上升過程中捕捉到更多的熒光變化信息，如O-P變化過程中的另外兩個拐點（J點和I點）。從10μs最長到300s（Handy-PEA）內(nèi)不同時間的熒光信號都能被按時記錄。在對快速葉綠素熒光誘導動力學曲線作圖時，為了更好地觀察J點和I點，一般把代表時間的橫坐標改為用對數(shù)坐標，使呈現(xiàn)出O-J-I-P誘導曲線（圖3B）。與調(diào)制式熒光儀相比，連續(xù)激發(fā)式熒光儀有以下很多優(yōu)點：獲得信息量大、操作簡便快捷、測定易于多次重復；儀器便于攜帶、存儲量大、價格低廉。
圖2 用脈沖調(diào)制式熒光儀測定熒光參數(shù)的葉綠素熒光動力學曲線
（注：引自許大全著《光合作用效率》2002）
參考文獻：
Genty B, Briantais JM, Baker NR (1989). The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim Biophys Acta, 990: 87-92
Demmig-Adams B, Adams WWIII (1996). Xanthophyll cycle and light stress in nature: uniform response to excess direct sunlight among higher plant species. Planta, 198: 460-470
李鵬民, 高輝遠, Strasser R J. 快速葉綠素熒光誘導動力學分析在光合作用研究中的應(yīng)用. 植物生理與分子生物學學報, 2005, 31(6): 559-566
Li PM, Gao HY, Strasser RJ. Application of the chlorophyll fluorescence Induction dynamics in photosynthesis study. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2005, 31(6): 559-566
許大全. 光合作用效率. 上海: 上海科學技術(shù)出版社, 2002
