激光掃描共聚焦顯微鏡在生命科學中的應用

實驗目的與要求
1. 掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理及其在生命科學中的應用。
一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理
1.普通熒光顯微鏡的不足
使用熒光物質標記細胞中的特定成分或結構，不僅圖像與對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61 λ/
NA
）。但當所觀察的熒光標本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結構模糊、發虛，原因是大多數生物學標本是層次區別的重疊結構）。
Laser Scanning Confocal Microscope


2. 共聚焦掃描顯微鏡的成像原理
采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。
Confocal Principle


每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結合，通過累加連續層次的二維圖像，經過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。

LSCM的基本特點
觀察方式：以熒光為主
光源：激光（紫外、可見光、近紅外）
照明方式：點照明、逐點掃描
成像方式：共聚焦、逐點成像
輸出：實時觀測,數字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察

3. 共聚焦掃描顯微鏡在生命科學研究中的應用
細胞結構、蛋白質（如受體、抗原、抗體、酶、細胞
骨架蛋白等基因表達產物）、DNA、RNA等
細胞膜流動性（熒光光漂白恢復技術）
細胞內氧自由基活性
細胞內鈣離子濃度變化
膜電位



三、試劑與器材
青蛙
冷丙酮、 DAPI 、甘油/PBS封片劑、濾紙、吸管、載玻片、蓋玻片
激光掃描共聚焦顯微鏡

四、實驗步驟
1.取涂有細胞的載玻片（細胞涂在中間），冷丙酮40C固定10min;
2.PBS漂洗2次，每次3 min;
3.滴加DAPI溶液100 ul室溫孵育30 min;
4.PBS漂洗3次，每次5min;
5.滴一小滴甘油/PBS封片劑(pH8.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封片;
6.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

五、注意事項
注意染色時間
注意避光