激光掃描共焦顯微鏡技術及應用

激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM )是20世紀80年代發展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產品，是當今世界最先進的細胞生物學分析儀器。它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發熒光探針，利用計算機進行圖象處理，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究。已廣泛應用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經生物學等領域。

一. 組成
倒置或直立熒光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測針孔、熒光濾片系統、鏡掃描系統和光電倍增管)、掃描頭控制電路、計算機和圖像輸出設備

二. 原理
Confocal
利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統在樣品焦平面上掃描，從而產生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續的光切圖像。

三. 激光掃描共焦顯微鏡的設計特點:
1.點照明
2.具有照明pinhole和探測pinhole
3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦), 共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面
4.具有掃描系統―― 逐點掃描成像
5.具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個被標記物
例如: Leica TCS NT 的技術指標:
1. xy分辨率比傳統顯微鏡小1.4x
傳統顯微鏡: Rxy=0.61l/NA
Confocal: Rxy=0.4l/NA
2. 樣品的最大厚度:大約 2mm(10X/0.2物鏡)
取決于三點:
物鏡的景深, 與NA成反比
Z軸的最大移動范圍
激光的穿透力
3. 樣品的最小光切厚度: 大約0.35 mm
取決于兩點: 物鏡的數值孔徑NA
Z軸的最小移動步距: 40nm
Z軸的分辨率: 0.35 mm
4. 激光器
Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm
Ar激光器(UV): 361nm
激光器的特點:
1) 方向性好: 激光基本眼直線傳播
2) 單色性好 l=10-8nm
3) 高亮度: 激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集中的
4) 偏振性: 激光為平面偏振光, 光纖耦合
5. 四個熒光通道, 一個透射光通道, 即除了可同時采集
多標記熒光圖像外還可以同時采集透射光圖像,但透
射光圖像為非共焦圖像

四. 共焦顯微鏡的類型：
1.點(慢)掃描共焦顯微鏡: 分辨率高, 圖像清晰;
噪音低;
采集圖像速度慢;
目鏡中觀察不到共焦圖像;
2.線(狹縫)掃描共焦 顯微鏡(video rate): 分辨率低;
噪音高;
掃描速度快 240幅/秒;
目鏡中可觀察到共焦圖像
3.Nipkov轉盤式掃描共焦顯微鏡: 性能介于上述兩者之間
功能:1.多熒光標記樣品的圖像采集
2.無損傷、連續光學切片，顯微“CT”
3.真正的三維重組
4.假三維圖的顯示
5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進行光切
6.定量分析
7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 掃描―― 時間序列掃描
8.圖像處理
9. 旋轉掃描
10.區域掃描
11.光譜掃描

五、激光掃描共焦顯微鏡技術的應用
定位、定量
三維重組
動態測量
*活細胞或組織內游離Ca2+濃度的測量
*活細胞內H+濃度（ pH值）的測量
*自由基的檢測
*藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量
應用：細胞膜電位的測量
熒光漂白恢復（FRAP）的測量
籠鎖解籠鎖的測量
熒光能量共振轉移（FRET）的測量

其他應用
1、定位、定量
免疫熒光標記（單標、雙標或三 標）的定位、定量。如：細胞膜受體或抗原的分布，
微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位
細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位雜交-fitc + PI
熒光原位雜交： 染色體基因定位
單細胞凝膠電泳
GFP的表達
游離Ca2+ 的分布與定量
定位、定量研究中常用熒光探針
1）Amine-Reactive Probes與抗體耦聯、與配體耦聯、與肽耦聯、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等
2）FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
3）異硫氰基熒光素 494/518
4）TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
5）Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618
6）PE 藻紅蛋白 565/578
7）cy3 490/530
8）cy5 650/690

(1)細胞表面抗原、胞內某種蛋白
免役熒光標記： 與抗體耦聯,
直標: 一抗+熒光探針
間標: 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白 抗 tublin抗體+熒光探針 肌動蛋白 Palloidine+熒光探針

(2)細胞膜表面受體
配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)
標記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC

2.標記細胞器熒光探針
(1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細胞，陽離子性,可檢測線粒體膜電位, 且在多數細胞中停留時間短
JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發綠光
線粒體膜電位低時為多聚體 490/590 發紅光
可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電
位最佳探針: Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞 ,
穩定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 還原型, 只能染活細胞
(2)溶酶體 Lysosome中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器官為非特異性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞 LysoTracker Blue LysoTracker
Red
(3)內質網 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標記內質網,較低濃度標記線粒體
(4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞 ¨細胞器的單克隆抗體
(5)細胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細胞
碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞
Hochest 33258 (同上)
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活細胞
460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細胞
SYTO 活細胞

3. GFP 綠色熒光蛋白
GFP的的發現：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經證實在水母體內還存在另外一種發光蛋白即綠色熒光蛋白
GFP, 后經研究表明，在水母體內Ca2+和腸腔素與水母發光蛋白結合后，水母發光蛋白產生藍色熒光，GFP在藍光的激發下，產生綠色熒光。將外源基因與GFP DNA
相連, GFP可作為外源基因的報告基因實時監測外源基因的表達.
GFP主要應用: 對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態觀察
如: 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達
GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞, 可動態觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程
GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網、高爾基體、線粒體等細胞器的
結構及病理過程:定位與定量測量應注意的問題
定位：1.可以對圖像進行修飾，
2.pinhole 可盡可能的小。
3.確認共定位時要取兩個通道熒光相互干擾的對照圖像

定量：
1.儀器的各個條件必須一致
2.必須用原始圖像進行定量測量
3.Pinhole盡可能的大

六.顯微CT與三維重組
光切的層數：VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX
七.動態測量 Physiology:細胞內離子動態變化測量
1).游離Ca2+測量
檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結合時不發熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內，被細胞內酯酶水解后并與胞內游離鈣結合后發出熒光。Kd值為Ca2+解離常數，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,
Kd和很多因素有關，如pH、 Mg2+、與蛋白的結合、溫度等。細胞內生理Ca2+濃度值(10-100n
M)，細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）
熒光探針 激發波長 發射波長 Kd
FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM
Fluo4 506nm 525nm
Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM
Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM
Fura red 420/480nm 637nm 140nM
Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM
Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM
Indo-1 356nm 405/458nm 230nM
Fura-2 340/380 476nm 145nM

相對測量
DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+濃度絕對測量
單波長公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM
[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
Fmin: 細胞內無鈣時的熒光強度( MnCl2)
Fmax：細胞內鈣飽和時的熒光強度(A23187)
測量時切記細胞內靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（F值不低于40）
細胞內生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）
細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）
標準曲線法：根據儀器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA-
Ca2+)做標準曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強度
比例熒光的測量：雙波長(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380,
440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2

細胞器的Ca2+測量
1.線粒體內游離Ca2+測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色）
2. 特異定位的重組水母發光蛋白 水母發光蛋白與 Ca2+結合后發藍光
用含有水母發光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉染細胞，可測定亞細胞器內的游離Ca2+變化目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內質網、細胞核內的游離Ca2+，因生物發光很弱不能使用Confocal
檢測

細胞內游離Ca2+測量的應用：
鈣的特性
1．細胞內外的電化學梯度103-104倍
2．細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導致胞內鈣明顯升高
3．細胞內鈣為細胞激活“開關”

細胞內鈣的生理作用
1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯
2．神經遞質的釋放
3．學習記憶的增強
4．卵子受精
5．細胞分裂和再生
6．細胞調亡
7．細胞間通訊
8．細胞信號傳導
9. DNA合成

10. 基因表達
細胞內鈣超載與疾病
1．高血壓、腦缺血、心臟病、內分泌病―胞內鈣濃度異常
2．糖尿病、風濕性關節炎、多發性硬化病―胞內鈣濃度增高
3．人體缺鈣―骨鈣大量丟失，神經細胞的鈣濃度增高
4．老化和老年性癡呆-神經細胞內鈣濃度增高
細胞內生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M），細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）

八.熒光漂白恢復(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)
定義:經熒光探針標記的細胞的某一區域一旦被高強度的激光照射后,熒光物質的光化學結構被迫壞,熒光強度下降, 且為不可逆的過程, 但此處熒光強度會漸漸恢復,
熒光強度和恢復的快慢和多少,代表周圍分子擴散的速率, 或分子運動速度。
R=(I2-I1 /I0-I2)100%
R-熒光漂白恢復率：代表分子的運動速度
應用：細胞間通訊， 細胞膜流動性，蛋白分子的運動

九.籠鎖解籠鎖的測量
定義：籠鎖化合物全稱為光致不穩定籠鎖化合物，為人工合成的用隱蔽基團修飾生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，兩者間的共價鍵幾解離而釋放出活性分子，這一光解作用稱為解籠鎖。
籠鎖化合物的種類：籠鎖的神經遞質、籠鎖的第二信使、籠鎖鈣等

十．熒光能量共振轉移( fluorescence Resonance Energy
Transfer)能量轉移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。
能量共振轉移：分子可以看作為正負電荷分離的一個偶極子，受激發以一定的頻率振動，如果其附近有一個振動頻率相同的另一分子存在，則通過這兩個分子之間的偶極-偶極相互作用，能量可以非輻射方式從前者轉移到后者，這種能量轉移稱為共振轉移。
熒光能量共振轉移的條件
兩個熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm，供體的發射波長與受體的激發波長一致
檢測：
以FL1的激發波長的光照射樣品，沒有共振轉移時，只檢測到FL1的發射光(綠光)，發生共振轉移時，就可檢測出FL1的熒光(綠光)減弱，FL2(紅光)的增強。
應用：檢測大分子的相互作用
大分子構象的改變(蛋白)，例：大分子(亞基)的結合與分離受體與配體的結合 ，常用熒光探劑：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP

十一 .其它應用
生物材料,例: 細胞在生物材料中的生長狀態及分布

激光掃描共焦顯微鏡的發展趨勢：
連續光譜型Confocal
多光子激光掃描顯微鏡