瑞沃德直播：腦缺血模型構(gòu)建及血流監(jiān)測技術(shù)

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Q1：組織剪切的大小有沒有具體要求，腫瘤組織一般2-4mm可以嗎？
A1：這要根據(jù)組織類型去判斷，一般會預處理成10mm左右的組織塊，太大可能會導致處理不完全，太小可能導致細胞死亡增加，甚至導致樣本變稠等。

Q2：細胞活率80%就可以了嗎，看到一些資料寫的都要90%以上。
A2：這個需要根據(jù)下游實驗的需求靈活調(diào)整，如果樣本存活率不能達到要求的話，除了優(yōu)化實驗條件以外，還可以通過一些死細胞去除的試劑來優(yōu)化已獲得的樣本。

Q3：低溫解離細胞與常規(guī)的37度制備單細胞優(yōu)勢分別是什么？區(qū)別是什么？
A3：37℃條件下進行組織解離，由于細胞轉(zhuǎn)錄活躍，因此解離過程中基因表達可能會發(fā)生改變，可能會干擾應激反應相關基因表達，所以在進行snRNA-seq時可以通過使用冷活性酶釋放細胞核，同時一些熱敏感或者脆弱的細胞更適合采用低溫解離的分離方式，但是低溫條件對一些質(zhì)密難解離的組織的處理效率可能會降低。

另外，溫度對不同細胞種類也有一定影響，比如在進行腦組織解離時，熱解離可能會影響神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的獲取，但是會大量富集小膠質(zhì)細胞，所以在進行組織解離時，根據(jù)獲得目的細胞的需求要靈活調(diào)整解離方案。

Q4：裂紅處理有什么注意事項嗎？
A4：如果直徑6-8μm的細胞占比較高，且有核率偏低，這表明紅細胞含量可能較多，需要進行紅細胞裂解，如果紅細胞裂解依然不干凈，不建議增大裂解體系，建議適當延長裂紅時間，或適當增加裂紅次數(shù)。

Q5：流式染色時間及溫度如何選擇？
A5：染色本身取決于抗體抗原之間的結(jié)合能力，染色時間和溫度，受限于抗體濃度，一般根據(jù)選擇抗體的說明書推薦的濃度和孵育時間、溫度選擇。我的實踐經(jīng)驗：當不清楚說明書的情況，我會選擇室溫染色12-15min（取決于抗體濃度微調(diào)），或4度冰上30min。注意染色時間盡量不要讓細胞破損，否則死細胞碎片會影響流式結(jié)果。此外細胞消化完畢后應該盡快染色處理，特別是一些凋亡染色、胞內(nèi)酶染色為保持細胞物質(zhì)活性，應最好盡快染色。

Q6：請問流式細胞實驗中單抗進行熒光需要什么樣的對照？
A6：關于對照設置，這個比較復雜，一般我們最好是選擇同型對照作為陰性對照組，得到的結(jié)果往往是比較好的。所謂的同型對照就是同種屬同亞型、相同熒光標記物、使用劑量和濃度相同，且屬于非特異性結(jié)合的抗體為同型對照組。通常用來消除抗體與抗原的非特異性結(jié)合造成的背景染色。

還有一類就是最常見的純陰性對照，檢測細胞群不進行任何抗體處理，直接進行流式檢測，這就是簡單消除細胞和溶劑本身的影響，這種方法的好處是節(jié)約抗體，畢竟抗體很貴。

Q7：如何減少補償?shù)母蓴_？
A7：補償干擾往往是多激光的流式儀器才會發(fā)生一定干擾情況，此時，可以根據(jù)抗體公司提供的染料搭配方案選擇比較好，也就是發(fā)射光譜的波長峰盡量不重疊的染料，這樣補償干擾會盡量消除。因此，往往需要查看染料的波長范圍，此外，對于4色以上的多色標記情況，一般不常見，此時往往染料的波長范圍難以避免的重疊，這時候，推薦使用抗體公司推薦的配色方案，盡量避免發(fā)射光譜的重疊。此外很多流式儀器配套軟件都帶一定算法對補償進行修正，可以適當修正這個影響。

Q8：細胞自發(fā)熒光如何解決？
A8：細胞自發(fā)熒光往往是細胞內(nèi)物質(zhì)帶有熒光，植物細胞因為葉綠素原因會自帶一定熒光，然后一些藥物處理下，藥物本身帶有發(fā)色基團，也可能自熒光，此時，純陰性對照的設置可以補償一定的情況。然后就是染料的選擇情況，染料熒光波長范圍避免與細胞自發(fā)熒光的波長的重疊，這樣會比較好一些。我之前做藥物的細胞凋亡實驗時候，考慮到藥物的情況，就沒有使用常見的凋亡檢測的Annexin V染料，而改用Annexin V-APC 。盡量設置純陰性對照、有條件做下同型對照，往往可以在數(shù)據(jù)處理時候適當減少部分因素的影響。這樣流式的結(jié)果會更好！

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