伯豪生物助力 《Cancer Letters》發(fā)現(xiàn)治療ICC新靶標(biāo)

肝內(nèi)膽管癌（ICC）是引起原發(fā)性肝癌的重要原因之一。由于化療的無效性和術(shù)后生存率的低比例，尋找治療ICC的有效靶點(diǎn)一直是科學(xué)家關(guān)注的重點(diǎn)。來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部的研究人員通過臨床樣本，細(xì)胞系功能實驗的研究，發(fā)現(xiàn)PDZ binding motif（TAZ）的異常表達(dá)與病人生存率相關(guān)，且通過調(diào)控p53/CYP24A1 pathway 影響細(xì)胞凋亡和對Vitamin D3 的敏感性。該研究的發(fā)現(xiàn)為治療ICC提供了一個新的治療靶標(biāo)。

1. TAZ在病人中的表達(dá)模式特征
TAZ被發(fā)現(xiàn)是Hippo-related pathways的核效應(yīng)靶點(diǎn)而調(diào)控器官大小，腫瘤干細(xì)胞性能和腫瘤發(fā)現(xiàn)。但是，TAZ是否與ICC有關(guān)聯(lián)，目前還沒有相關(guān)研究。研究人員首先在41對ICC病人組織樣本進(jìn)行了免疫組化實驗，發(fā)現(xiàn)tumor grade和tumor stage與TAZ表達(dá)呈正相關(guān)。

對12對ICC樣本進(jìn)行RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)，TAZ mRNA的表達(dá)在腫瘤組織中明顯高于癌旁組織。對41個病人術(shù)后生存率分析顯示，高表達(dá)TAZ組伴隨著低生存率，而低表達(dá)組的相對生存率明顯高。因此，TAZ的表達(dá)與ICC有著密切的關(guān)聯(lián)。

2. 敲降TAZ細(xì)胞系表型分析
為探究TAZ表達(dá)與ICC發(fā)生的關(guān)系，研究人員首先在ICC細(xì)胞系中分析了蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在CCLP-1和RBE中顯著高于TFK-1和HCCC-9810細(xì)胞。因此，在CCLP-1和RBE中進(jìn)行了TAZ的敲降。結(jié)果顯示，敲降TAZ后細(xì)胞活性被顯著抑制。

流式細(xì)胞分析表明，敲降TAZ后，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，G1 phase阻滯增加。Western blot檢測限制，Bak, Bad, Bax, caspase 3的表達(dá)顯著上調(diào)，CDK2，CDK4，cyclin D1表達(dá)下調(diào)，因此，TAZ的敲降影響了細(xì)胞的增殖，凋亡和細(xì)胞周期過程。

3. TAZ調(diào)控下游基因篩選
那么，TAZ是調(diào)控了下游哪些基因的表達(dá)而影響細(xì)胞的上述生物學(xué)功能呢？通過全基因組表達(dá)譜芯片（該研究中Affymetrix Human U133 plus2.0 array芯片服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供），研究人員發(fā)現(xiàn)CYP24A1的mRNA表達(dá)在TAZ敲降后顯著下調(diào)。RT-PCR和western bolt實驗，進(jìn)一步驗證CYP24A1在敲降后顯著下調(diào)。CYP24A1在ICC腫瘤組織中的表達(dá)與TAZ正相關(guān)。因此，CYP24A1是潛在的TAZ作用下游靶基因。

4. TAZ影響ICC細(xì)胞對vitamin D的敏感性
通過對ICC細(xì)胞處理vitamin D，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性受到抑制。而在TAZ敲降后，ICC的敏感性增加。當(dāng)在細(xì)胞中處理si-TAZ時，同時處理vitamin D，發(fā)現(xiàn)兩則是一種協(xié)同增強(qiáng)作用。因此，TAZ的降低增強(qiáng)了ICC細(xì)胞對vitamin D的敏感性。

5. TAZ調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析
那么，TAZ是怎么樣調(diào)控CYP24A1和VDR（vitamin D receptor）呢？結(jié)果顯示，敲降TAZ降低了VDR的表達(dá)，升高了p53, p27, p21的表達(dá)。vitamin D可以有效下調(diào)VDR，CYP24A1，TAZ的表達(dá)，上調(diào)p53的表達(dá)。當(dāng)以si-TAZ, vitamin D3, si-TAZ+ vitamin D3處理細(xì)胞時，在組合組中，p53和p21顯著增加，VDR和CYP24A1顯著降低。exnograft實驗來源腫瘤的免疫組化檢測也表明p21, p27, p53, Bak, Bax表達(dá)增加，而CYP24A1, VDR, Bcl-2, CDK2 , Ki-67表達(dá)降低。此外，通過構(gòu)建si-CYP24A1，發(fā)現(xiàn)TAZ表達(dá)降低，VDR不變。當(dāng)增加Nutlin3a（MDM2拮抗劑）量，p53表達(dá)逐步上調(diào)，TAZ和CYP24A1表達(dá)逐步下調(diào)。當(dāng)將p53進(jìn)行siRNA設(shè)計時，CYP24A1表達(dá)上升。因此，在ICC中，可能是由于TAZ通過抑制p53的表達(dá)，影響了對于Vitamin D3的敏感性，抑制了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。

本研究通過對臨床樣本分析，發(fā)現(xiàn)TAZ的表達(dá)與病人生存期，腫瘤分期顯著相關(guān)。利用敲降細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)TAZ通過影響p53/CYP24A1 pathway ,影響了細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞周期和對vitamin D的敏感性。該研究在ICC中發(fā)現(xiàn)了一個潛在的治療靶點(diǎn)，為治療ICC提供了新的思路。

原文出處：Xiao H, Tong R, Yang B, Lv Z, Du C, Peng C, Ding C, Cheng S, Zhou L, Xie H, Wu J, Zheng S. TAZ regulates cell proliferation and sensitivity to vitamin D3 in intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Lett.2016.