IPHASE召開PBMC制備方法及注意事項研討會

IPHASE/匯智和源于2023年2月20日于北京總公司舉行了本年度第二場研討會，在IPHASE/匯智和源技術總監的指導下，就外周血單個核細胞（PBMC）制備方法及注意事項與大家進行了探討。

IPHASE/匯智和源順應藥物開發和免疫學研究等的需求，不斷優化PBMC的提取工藝，形成了各種屬高質量的PBMC產品，如人PBMC、猴PBMC、犬PBMC、大鼠PBMC、小鼠PBMC、貓PBMC、小型豬PBMC、兔PBMC等。根據客戶的使用要求和習慣，我們可提供新鮮分離和液氮凍存兩種形式的PBMC產品，客戶可根據實際需求和產品自身特性選擇并訂購滿足要求的產品。新鮮分離的PBMC可很大程度的保留PBMC中稀有細胞的占比，但貨期相對較長，試驗時間需根據提取時間調整；液氮凍存的PBMC復蘇存活率可達90%以上，基本可滿足大部分客戶的需求，隨用隨取，可任意安排試驗時間，但凍存難免會對細胞造成一定的損傷，如需研究稀有細胞難免會對試驗結果造成一定干擾。

一、外周血單個核細胞（PBMC）

外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）是外周血中具有單個核的細胞，是白細胞（WBC）的一個子集，白細胞是機體免疫系統對抗疾病的組成部分。PBMC主要由淋巴細胞（T細胞、B細胞和NK細胞）和單核細胞組成，通過密度梯度離心從外周全血中分離。PBMC被廣泛應用于藥物發現/開發、分析驗證/開發和其他免疫學相關研究中。

Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400,000，當密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。 PBMC中大部分都是淋巴細胞，包括B細胞和T細胞，其中CD3+T細胞又占了淋巴細胞中絕大部分(45-70%)。這些T細胞都處于初始（naive）狀態，即已經成熟了但沒有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T細胞會因抗原識別而被激活。同樣的B細胞也都處于初始狀態。相對于淋巴細胞，單核細胞的比例在10-30%，收到刺激之后會發育成樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞。干細胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很難從全血樣本中分離到。 二、外周血單個核細胞（PBMC）制備方法

1.設備與試劑
全血 （以10ml為例）
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培養基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
雙抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亞砜（DMSO）（SIGMA）
預先裝好異丙醇的凍存盒

2.方法/步驟
配制所需的溶液：
a. 細胞培養基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 細胞凍存液：FBS中加入10%DMSO；
  （1）在離心管中加入淋巴細胞分離液Ficoll
（2）取抗凝外周血（全血）與無菌PBS按照1:1充分混勻，用移液管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，動作一定要輕，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴細胞分離液最終體積比為1:1:1。
（3）水平離心400g×30分鐘（可根據淋巴細胞分離液Ficoll或離心機轉子要求調整）
（4）離心后可看見管內分為三層，上層為血漿和PBS，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液。在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，主要就是單個核細胞，包括淋巴細胞與單核細胞。此外，還含有血小板。
（5）去除部分上層液體，余下約1mL，用移液器插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一離心管中，加入5倍以上體積的PBS，離心300g×10分鐘，洗滌細胞兩次。
（6）末次離心后，棄上清，加入紅細胞裂解液，室溫孵育2分鐘，裂解紅細胞，可根據情況適當增減時間。
（7）加入10mLPBS，離心300g×10分鐘，洗滌細胞兩次。
（8）末次離心后，棄上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重懸細胞，計數，計算細胞活力。

三、注意事項

全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層，但是最終都必須保證兩種溶液分層清晰。
分離PBMC第一步離心的時候，一定不能設置低水平的制動。否則將分層混亂。

四、細胞運輸與保存

（1）干冰運輸，收到細胞后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；
（2）T25瓶運輸細胞，收到后應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存，具體操作步驟見細胞培養步驟。

五、PBMC收到后注意事項：

（1）收到PBMC細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時反饋。
（2）先不打開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放培養箱靜置四小時，穩定細胞狀態，切忌在溫箱內靜置過夜。
（3）靜置后鏡檢，拍照，記錄細胞狀態。建議傳代后也拍照記錄細胞生長情況。
（4）貼壁細胞：若細胞密度超過80%，可正常傳代；若未超過80%，收集細胞瓶內的培養基，留8ml繼續培養至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。
（5）細胞瓶內的培養基含血清和雙抗，可收集后4℃保存備用，可補加2%血清。剛開始傳代時建議一半用細胞瓶內的培養基，一半用自備的培養基，使細胞逐漸適應培養條件，以免因不適應而造成生長狀態不佳。
（6）細胞胰酶消化液建議使用PBS配制。

六、IPHASE產品特點

l  來源清晰

IPHASE/匯智和源生產PBMC所用血液均由正規生產商采集，進口的人PBMC產品均有倫理和知情，免除了后顧之憂。

l  產品安全  

IPHASE/匯智和源PBMC生產所用動物均經過傳染源檢測，使用更安全、更放心。

l  純度高

IPHASE/匯智和源的PBMC產品均根據種屬特異性使用專用分離液進行提取，產品純度高。

l  活性好

IPHASE/匯智和源的PBMC產品復蘇活性較好，可達90%以上。

除此之外，IPHASE/匯智和源可根據客戶特殊需求，提供不同種屬和特殊種屬動物PBMC產品的定制服務和人PBMC產品的進口服務，望廣大科研工作者來電咨詢。
 
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匯智和源，致力于為創新藥研發企業及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。